[发明专利]一种长效重组人脑钠肽融合蛋白及其制备方法与用途

权利要求书

1.一种重组hBNP-Fc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.:4所示。

2.一种编码如权利要求1所述的重组hBNP-Fc融合蛋白的核酸序列，其特征在于所述核酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

3.一种如权利要求1所述重组hBNP-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于所述制备方法包含如下步骤：

(1)构建编码重组hBNP-Fc融合蛋白的基因表达载体；

(2)构建高表达重组hBNP-Fc融合蛋白的工程细胞株；

(3)批次流加培养工程细胞株，以表达重组hBNP-Fc融合蛋白；

(4)重组hBNP-Fc融合蛋白的分离纯化；所述步骤(1)的具体步骤为：采用人工合成方法获得编码重组hBNP-Fc融合蛋白基因的核苷酸序列插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒；所述步骤(2)的具体步骤为：将步骤(1)所得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒转染到合适的哺乳动物宿主细胞，并筛选获得稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株；所述步骤(3)的具体步骤为：将步骤(2)所得稳定高表达的CHO细胞株，经过驯化完全适应无血清悬浮培养后，进行放大培养得到细胞培养液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中使用的哺乳动物细胞表达载体为pCDNA3.1(+)、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK或pSPORT。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中使用的哺乳动物宿主细胞为CHO、HEK293、COS、BHK、NS0或Sp2/0细胞；所述转染的方法为磷酸钙法、电穿孔转染法或脂质体转染法；所述的筛选稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株的方法为：先利用筛选标记进行筛选，然后用扩增选择性标记可提高表达量并获得稳定高表达哺乳动物细胞株；所述筛选标记为ZEO、NEO、PUR、HYP、GFP或RFP；所述扩增选择性标记为DHFR序列或GS序列。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中表达重组hBNP-Fc融合蛋白所用细胞培养条件是：在37℃，溶氧50％，pH7.0条件下放大培养，当细胞密度达到2.4×10⁶cells/mL时降温至30℃继续培养12天，并使用EX-CELL^TM 302无血清基础培养基中添加超滤植物蛋白胨或营养物质添加剂所得到的培养基。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)包含如下步骤：

a)澄清：将步骤(3)所得到的细胞培养液通过离心、深层过滤以及二者的任意组合方法，以获得上清液；

b)亲和层析：根据融合蛋白含有Fc片段的特性，利用带有可结合Fc片段的配体的填料对步骤a)所得的上清液进行亲和层析；

c)疏水层析：采用疏水层析柱进一步去除步骤b)纯化后目标蛋白中的杂质；

d)羟基磷灰石层析：将步骤c)所得目标蛋白经羟基磷灰石层析纯化进一步去除目标蛋白中的杂质；所述的羟基磷灰石层析柱使用的填料是CHT Ceramic Hydroxyapatite TypeI填料；

e)超滤：采用超滤的方法进一步浓缩目标融合蛋白原液。