[发明专利]一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子

说明书

本发明涉及一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子及其快速制备方法和应用，该血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly‑Tyr‑Ile‑Cys‑Pro‑Gln‑Trp，ESI‑MS检测分子量为865.98 Da。该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管生成，并对荷Lewis肺癌小鼠肺癌组织的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用。

技术领域

本发明涉及一种海洋生物活性多肽，尤其涉及一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子。

背景技术

肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成，采用抗血管疗法治疗肿瘤具有高效、低毒、不易产生耐药性的优点。因此，寻找活性显著地血管生成抑制因子成为抗肿瘤药物的研究热点。肿瘤血管生成受多种因子影响，而血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的血管生成因子，也是内皮细胞VEGF信号转导的主要执行者，直接参与新生血管形成过程。研究表明VEGF必须通过与位于细胞膜上的特异性受体VEGFR-2结合来发挥作用，因而以VEGFR-2为靶点进行药物筛选成为抗肿瘤血管生成的重要策略。

制备和筛选方法在抗肿瘤药物研究中非常重要，而常规的方法费时长，所得到的活性物质假阳性率高，而比较理想的制备和筛选方法应是将制备方法和筛选方法有效结合，最大限度地保证抗肿瘤药物研发的成功率。

软骨鱼软骨富含多种抗肿瘤活性物质，主要包括血管生成抑制因子、抗肿瘤因子和抗入侵因子，但目前尚未得到有效利用。虽已有报道从赤魟、孔鳐等软骨中制备血管生成抑制因子，但得到的活性物质因为分子量大，含量低，而难以进行药物开发。

基于以上现状，本发明以赤魟软骨为材料，采用酶解和细胞膜色谱技术建立了肿瘤血管生成抑制因子的快速制备方法，并提供一种活性显著的赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种有显著的血管生成抑制活性的赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子。该赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp，ESI-MS检测分子量为865.98Da。

该赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子制备方法如下：

1)细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体(VEGFR)高表达的、处于对数生长期的肿瘤细胞，采用MEM培养基(含10％的胎牛血清)，于37℃、5％CO₂培养箱内培养。当细胞计数达到10⁵～10⁷时，应用胰蛋白酶将细胞消化下来，于4℃、1000r/min离心10～15min，取沉淀用生理盐水清洗2次后，加入到50mM的Tris-HCl溶液超声25～30min破碎细胞，将悬液于1000r/min、4℃条件下离心5～10min，取上清液于12000r/min、4℃条件下离心20～25min，得细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗2～3次后，加入生理盐水至膜蛋白含量为2.0～2.3mg/mL，即为细胞膜悬液；

2)细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温(4℃)反应管中，在振荡条件下，按照固液比1g：25～30mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15～20h，超声研磨20～25min后，于4000r/min离心10～15min，收集沉淀，用生理盐水洗涤2～3次，除去未结合的细胞膜，得细胞膜固定相；