[发明专利]一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法

权利要求书

1.一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法，其特征在于包括以下步骤 ：

1）细胞膜悬液的制备 ：取血管内皮生长因子特异性受体高表达的、处于对数生长期的肿瘤细胞，采用含胎牛血清的培养基，于CO₂培养箱内培养 ；当细胞计数达到10⁵～10⁷时，应用胰蛋白酶将细胞消化，然后离心，取沉淀；将沉淀用生理盐水清洗后，加入到50mM的Tris-HCl溶液超声破碎细胞，将悬液于1000 r/min、4℃条件下离心，取上清液于12000 r/min、4℃条件下离心20～25 min，得细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗后，加入生理盐水至膜蛋白含量为2.0～2.3 mg/mL，即为细胞膜悬液 ；

2）细胞膜固定相的制备 ：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温反应管中，在振荡条件下，按照固液比1g：25～30mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15～20h，超声研磨20～25min后，于4000 r/min离心10～15min，收集沉淀，用生理盐水洗涤2～3次，除去未结合的细胞膜，得细胞膜固定相 ；

3）赤魟软骨蛋白的制备与酶解 ：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比1g：10～15mL加入到1.0mol/L 盐酸胍溶液中，4℃、振荡抽提44～ 48h后，于4℃、10000r/min离心15～20 min，取上清液装入截留分子量为 1kDa 的透析袋中，用双蒸水于4℃以下透析22～24h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白 ；将赤魟软骨蛋白按固液比1g :15～20 mL 加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液中，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入酶活力≥ 1.0×10⁵ U/g的中性蛋白酶，酶解温度55～65℃，酶解3～4h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min，温度降至35～40℃，用NaOH调pH至7.5～8.0，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入胰蛋白酶，酶解温度为35～40℃，酶解3～4h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min，于10000r/min、4℃条件下离心15～20min，取上清液，上清液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，置于截留分子量为100的透析袋中，三蒸水透析24h，冻干，得酶解物活性组分；

4）赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备：将酶解物活性组分用三蒸水配成0.03～0.05mg/mL的溶液，将细胞膜固定相按照固液比1g:10mL加入到活性组分溶液中，35～40℃保温孵育2～3h后，4000 r/min离心10～15min，留取上清液，沉淀用三蒸水淋洗8～10次，合并洗涤液和上清液，冻干，即为细胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC建立酶解物活性组分和细胞膜吸附剩余物的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积显著减小的差异峰，并对其进行鸡胚绒毛尿囊膜CAM血管生成抑制作用测定，活性最强峰经蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp，ESI-MS检测分子量为865.98Da；

所述步骤1）中的肿瘤细胞为肝癌细胞Bel-7402；

所述步骤2）中大孔球形硅胶的预处理方法为：将规格为5μm的200Å大孔球形硅胶中加入HCl溶液，超声处理15～20min，转移至圆底烧瓶瓶中搅拌回流水解2～3h后，将硅胶移至烧杯中，加双蒸水洗涤3～5次，每次25～30min，将洗涤处理好的大孔球形硅胶减压抽干，于120℃下活化6～8h；

所述步骤4）中的RP-HPLC条件为：进样量为5～10μL；色谱柱是规格为250mm×4.6 mm，5μm的Amethyst C18；洗脱条件为0～40min内乙腈浓度由10%匀速升至50%；流速0.4mL/min；紫外检测波长为215nm。