[发明专利]藏药马尿泡快繁体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及藏药马尿泡快繁体系的建立方法。

背景技术

马尿泡(Przewalskia tangutica Maxim.)又名矮莨菪，是茄科(Solanaceae)马尿泡属植物，为我国青藏高原特有植物；生长于海拔3200-5000米的高山砾石地及干旱草原。据《晶珠本草》及《藏药志》记载，它是藏药中的常用药，其根和种子及全草均可做药用，具有镇痛、解痉、杀虫、消炎等药效，用于胃肠痉挛疼痛、白喉、炭疽；外用疮疡，皮肤瘙痒。1984年，肖培根等，对茄科中的三分三，唐古特山莨菪，马尿泡等54中植物的托烷类生物碱有效成分进行分析，结果发现马尿泡中托烷类生物碱含量高，可以直接作为工业生产该类药物的原料。

伴随着马尿泡药用价值的发现，大量野生资源被挖掘，一方面造成了马尿泡野生资源濒危，另一方面也造成高原地区脆弱的生态破坏。近年来研究表明，东莨菪碱作为一些药物合成的重要中间原料，也使得该化合物在国际市场上的需求增长很快，是莨菪碱的10倍。选用化学合成的方法存在成本高、生产周期长、合成有效成分的产量较低。因此，对高产东莨菪碱的马尿泡野生资源进行合理的开发研究，了解其高产东莨菪碱的机制，可能是解决东莨菪碱供求矛盾的有效途径，也是间接保护传统藏药资源，保护生态环境的有效办法。

目前，国内外对马尿泡的研究主要集中在细胞学，系统学，植物化学、组织培养等方面。有关马尿泡组织培养的研究主要以野生芽为材料，受季节性限制且野生芽经消毒后不易存活，繁殖速率低等问题，严重限制该植物资源的开发利用。传统的器官再生途径存在遗传变异大，可能会影响其体内生物碱的合成代谢，对后续研究产生影响。因此，建立在种子无菌苗基础上的茎段组织快速繁殖体系能够有效的解决上述问题。本实验在对马尿泡组织培养研究的基础上，分析了马尿泡组培苗各部分的四种生物碱含量变化，一方面为马尿泡种质资源的保存提供了技术参考，另一方面，为利用基因工程对马尿泡进行遗传改造，培育高产东莨菪碱的转基因植株或生物反应器提供了研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供藏药马尿泡快繁体系的建立方法，解决了东莨菪碱产量低的问题。

本发明所采用的技术方案是藏药马尿泡快繁体系的建立方法按照以下步骤进行：

第1步：马尿泡种子无菌苗的获得；将干燥的马尿泡种子放置于三角瓶中，用蒸馏水冲洗三次，每次遗弃漂浮的种子，将筛选好的种子用400ppm赤霉素浸泡24h，用蒸馏水冲洗三次，然后将处理好的种子放于超净工作台中，用乙醇水溶液消毒1min，无菌水冲洗3次，然后用NaClO水溶液消毒20min，无菌水冲洗6次，将经过消毒的马尿泡种子播种在装有30mlMS培养基的三角瓶中，在恒温培养箱中22℃暗培养，待种子发芽后转入光照培养箱培养，培养条件为光照条件：培养温度20℃-24℃，光照强度为3000lx，12h.d^-1光照条件下培养，黑暗条件：培养温度20℃-24℃。在光照培养箱生长25-30d获得长势一致的马尿泡种子无菌苗；

第2步：芽增殖；在超净工作台，将马尿泡种子无菌苗取出，切取带有腋芽的茎段，接种在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L固体培养基中，每瓶接种5个，培养条件：培养温度23℃-27℃，光照强度为3000lx，12h.d^-1光照条件下培养，获得大量长势一致的丛生芽；

第3步：丛生芽生根培养；在超净工作台上，将丛生芽取出，将丛生芽分割成带有1-2个芽体的外植体，然后将分离的芽体接种在MS+0.5mg/L NAA的培养基上，培养条件：培养温度23℃-27℃，光照强度为3000lx，12h.d^-1光照条件下培养，获得马尿泡快繁苗。

进一步，所述MS培养基配置方法：

1.称取NH₄NO₃41.25g，KNO₃47.50g，KH₂PO₄4.25g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加20mL母液；

2.称取CaCl₂·2H₂O 22g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；

3.称取MgSO₄·7H₂O 18.50g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；