[发明专利]一种质粒大规模制备工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种质粒大规模制备工艺。

背景技术

DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗，是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA疫苗(DNAvaccine)是由插入一种或多种外源基因的质粒DNA(来自细菌)和真核启动调控基因等元件构成的，载有外源抗原的质粒DNA在一种真核启动子和加尾信号以及相关增强子等基因单元的控制下，可在哺乳动物的各类细胞中表达出相关的抗原蛋白。将重组有外源抗原编码基因的质粒，利用某种方法直接导入人或动物的细胞内，通过宿主细胞的转录系统，在被免疫对象机体的活体细胞合成抗原蛋白，从而诱导机体产生免疫应答。DNA质粒被导入宿主细胞后，病原体抗原的基因片段在宿主细胞内得到表达并合成抗原，再经过加工、处理、修饰递呈给免疫系统，激发免疫应答。这一过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种，所以DNA疫苗能有效地激发体液免疫和细胞免疫，尤其是其具有激活杀伤性T淋巴细胞的作用。

质粒DNA提取纯化，是分子生物学中最基础的工作。获得一定纯度和一定量的质粒DNA，是保证后续研究工作成功的前提条件。如果质粒仅需电泳鉴定，通过简单的细菌裂解和醇沉淀步骤，获得少量的质粒DNA已可胜任。然而通常情况下，质粒DNA还需要酶切、测序鉴定，以及应用于体外转录、细胞转染等工作，就要求提取的质粒DNA有足够的含量和纯度。质粒提取中主要的杂质是基因组DNA、RNA、蛋白质、菌多糖(内毒素)等。提取纯化中还可能残留盐份、有机物等外来杂质。酚/氯仿抽提或氯化铯超离心是实验室小量及大量质粒纯化的经典手段。然而，酚/氯仿抽提仅能部分去除蛋白杂质；氯化铯超离心需要特定仪器，耗时费力，且成本高昂。

商品化的质粒提取纯化试剂盒，一般是通过一些基质材料吸附质粒DNA，清除其他杂质。各种试剂盒因采用的基质材料差异和清洗液体配方的不同，获得质粒DNA的总量、纯度各不相同。总的来说，柱离心纯化方法，对于普通质粒的小量提取和一般应用(如酶切、测序)应可胜任。

大量质粒提取纯化，采用柱离心的方法，往往存在回收率低、质量不稳定、操作麻烦、费时费力的缺点。国际上通行的大量质粒提取纯化技术，是采用特殊基质材料利用滤过吸附和清洗的方法，这种方法几乎成为国外一般实验室的唯一选择。在目前国内尚无同型产品生产能力的情况下，进口产品的“高贵”价格，成为这种“寻常”技术普及国内实验室的障碍。

近年来，随着分子生物学研究的拓展，核酸疫苗的临床试验，对质粒提取的量和纯度提出了更高的要求。因此对大规模高产量的质粒的纯化，无论是采用柱离心还是滤过吸附，都存在操作的困难，结果很难得到纯化的质粒。

发明内容

本发明的目的之一是为解决质粒大规模制备困难的问题，提供一种方便简单的质粒大规模制备工艺。

本发明提供一种质粒大规模制备工艺，包括以下步骤：

生产种子制备；

高密度发酵；

菌体收获；

去除RNA；

提取质粒；

质粒纯化。

进一步的，所述生产种子发酵步骤包括：

取典型菌落划线LB琼脂平板，37℃培养过夜，用0.01mol/L，pH7.2的PBS溶液洗下至LB液体培养基，分装于5mL灭菌小瓶，加10％甘油混匀，作为一级种子，-70℃保存，接种一级种子至含30μg/mL卡那霉素的LB培养基，趋饱和期的细菌提取质粒，PCR产物测序鉴定，无突变及其它非目的性重组产生即为合格的一级种子；

将合格的一级种子接种于50ml揺瓶培养基中，置摇床37℃，200r/min培养12h，作为二级种子，可用于小型发酵罐接种。如接种体积较大，可制备三级菌种。

进一步的，所述高密度发酵步骤包括：

接种：发酵罐中装入半合成培养液，高压灭菌后，冷却至37℃，按照接种操作规程分别加入二级种子、葡萄糖和卡那霉素，二级种子终体积为发酵罐半合成培养液体积的2％，葡萄糖终浓度为2g/L、卡那霉素终浓度为50mg/L。

恒速流加培养方式：设定培养温度37℃，pH值7.2，培养期间根据溶氧变化情况，逐渐提高搅拌转速和通气量，使溶氧保持在30％～40％之间，培养大约4h时开始补料，补料速度为100ml/h。培养至17h终止培养得，到发酵菌液。培养期间通过自动控制碱泵始终维持培养基的pH在7.0～7.2范围内。