[发明专利]蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于农业生产及进出境口岸上蓝莓休克病毒的快速检测和监测。

背景技术

蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus，BlShV)属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)成员，最早于1987年在美国的Highbush blueberry(Vaccinium corymbosum L.)上发现。BlShV现主要分布于美国的加利福尼亚、宾夕法尼亚州、纽约州、密歇根州和加拿大的新斯科舍省，该病毒基因组为+ssRNA，全长9650个核苷酸，病毒粒体呈等轴对称球状，直径约27nm。BlShV已报道的自然寄主为蓝莓，人工侵染寄主有本氏烟(Nicotiana benthamiana)、克利夫兰烟(Nicotiana clevelandii)、林烟草(Nicotiana sylvestris)和普通烟草(Nicotiana tabacum)。BlShV侵染蓝莓后引起的主要症状是开花期时花和叶片的突然完全坏死，但之后除引起不结果外，叶片仍会长出。受BlShV侵染的蓝莓通常在1～4年内表现症状，随之逐渐恢复并隐症。BlShV几乎可侵染所有的蓝莓品种，并表现相似的症状。据统计，BlShV侵染蓝莓造成的损失达34％～90％，损失大小与症状严重程度直接相关，且不同年份之间存在差异。BlShV可通过蜜蜂携带感染的花粉传播，因此在田间扩散速度相对较快。为预防和控制该病毒的发生和传播，建立有效的检测方法具有重要意义。

在普通RT-PCR基础上建立的巢式RT-PCR技术，具有快速、准确、灵敏和特异性强的突出优点，能够有效降低多个靶标被扩增的可能，避免假阳性的出现。但到目前为止，关于蓝莓休克病毒(BlShV)巢式RT-PCR检测方法的报道甚少，至今尚未见专门应用于该病毒快速检测的巢式RT-PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对农业生产及进出境口岸上蓝莓休克病毒进行快速、准确的检疫鉴定。

本发明技术方案如下：

(一)一种用于蓝莓休克病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCCCAAAGGATAAACAGGTCCA-3’；

2)外侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-TCACCACGTACAAATCCCT-3’；

3)内侧反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCCACCCAACCATTACCGAT-3’；

4)RT Buffer：5×；

5)RNA酶抑制因子：40U/μL；

6)反转录酶：200U/μL；

7)dNTPs：10mmol/L；

8)PCR Buffer：10×；

9)Mgcl₂：25mmol/L；

10)Taq DNA聚合酶：5U/μL；

11)蓝莓休克病毒的阳性对照样品；

12)不含蓝莓休克病毒的阴性对照样品；

13)RNase-free ddH₂O。

(二)上述蓝莓休克病毒巢式RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA 3μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL和RNase-free ddH₂O 7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 2μL、浓度为200U/μL反转录酶1μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子1μL，42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cDNA；