[发明专利]玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用。

背景技术

作物经常会受到各种各样的非生物胁迫，例如干旱、盐、低温等，严重制约了作物的种植区域，甚至导致产量下降^[1]。低温影响种子的萌发、幼苗的生长以及农业产量。为了抵抗或适应逆境，植物体感受外界环境的变化并将信号通过多种途径传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受低温胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号与调控基因表达的转录因子。许多响应低温的基因已被报道，比如COR(低温调控)，KIN(低温诱导)，RD(响应脱水)基因^[2、3、4]。三个熟知的CBFs转录因子在激活COR/KIN/LTI/RD基因的转录中扮演着重要的角色。过表达CBF/DREB1基因能提高转基因植株的抗逆性，或者提高逆境响应基因(COR15A,KIN1,RD29B)的表达。水稻OsP5CS2基因，一个脯氨酸生物合成酶，被证明对植物抗盐和抗低温是必要的。因此，鉴定抗冷相关基因对丰富低温代谢途径具有重要的意义。

玉米是世界产量最大、种植范围最广的禾谷类作物，居三大粮食作物之首。起源于亚热带地区，为低温敏感作物。但是由于地理条件原因，东北春季经常遭受低温冷害的侵袭，造成大面积的减产，尤其在严重低温冷害年，玉米减产可达20％以上，品质也随之下降。在此情况下，鉴定冷响应相关基因对培育抗冷玉米新种质新品种具有重要的经济价值。SEC14p是一类磷脂酰肌醇转运蛋白，在体外具有磷脂酰肌醇与磷脂酰胆碱转移活性，同时广泛存在于真核细胞中^[5、6、7]。其功能参与必要的生物学过程，比如磷脂代谢，细胞膜运动，细胞膜极性生长，信号转导以及逆境响应^[8]。许多报道发现磷脂酰肌醇转运蛋白参与非生物胁迫。高粱在氮胁迫下转录组分析表明：高丰度的磷脂酰肌醇转运蛋白能够提高对氮胁迫的抗逆性。Jeongyeo Lee报道低温胁迫下，SEC14细胞质因子家族蛋白在抗冷卷心菜中的表达更高^[9]。尽管这些证据表明磷脂酰肌醇转运蛋白受逆境的诱导，但还未见利用这些生物逆境相关基因提高植物抗冷性的报道。

发明内容

本发明的目的在于：(1)提供一种DNA序列，其是在耐冷玉米自交系W9816中克隆得到的编码磷脂酰肌醇转运蛋白的基因，命名为ZmSEC14p；(2)提供玉米磷脂酰肌醇转运蛋白的基因ZmSEC14p在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。

在下文中将详细描述本发明。

(一)本发明提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

将课题组自行培育的耐冷玉米自交系W9816培育至三叶期，于人工气候箱中低温(4℃)处理12h，采集叶片用于RNA的提取。根据cDNA-AFLP获得的候选基因片段，设计3’端、5’端巢式引物，利用RACE方法进行3’端、5’端扩增，将所得的PCR产物与PMD18-T载体连接，转化Top10大肠杆菌感受态，筛选重组子，并进行测序。测序结果经分析可拼接成完整的cDNA。根据拼接结果，设计特异性引物，获得耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p预期完整的cDNA全长序列。

耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p全长为1346bp，包括888bp的开放阅读框，251bp的5’UTR和207bp的3’UTR区，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，如SEQ ID NO:1所示。

(二)本发明提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白，由耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白由295个氨基酸组成，此蛋白包含保守的SEC14蛋白家族结构域(86-241aa)，N端包含CRAL-TRIO-N结构域(19-65aa)。与水稻(NP_001051120.1)，拟南芥(NP_195382.1)，大麦(MLOC_67500.1)，大豆(XP_003544415.1)，谷子(XP_004981935.1)，高粱(Sb01g009685.1)，小麦(EMS66889.1)和葡萄(XP_002266907.2)的氨基酸多重序列比较表明，这些蛋白在保守的SEC14结构域同源性很高。系统进化树分析表明，此蛋白与水稻亲缘关系最近，与拟南芥、酵母的亲缘关系较远。