[发明专利]抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源抗体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及了一株高亲和性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)的全人源抗体的筛选、制备方法及其潜在的用于肝癌和黑色素瘤治疗中的应用。

背景技术

肝癌是危害很广泛的一种恶性肿瘤，在世界范围内肝癌位居全部恶性肿瘤发病男性第5位、女性第7位，为恶性肿瘤死亡男性第2位，女性第6位。在发展中国家，其居男性恶性肿瘤发病第3位，女性第6位，居男性恶性肿瘤死亡第2位，居女性第5位。我国的乙型肝炎病人位居世界第一，这也直接导致我国肝癌病人高居全球榜首。调查显示，1973-1975年、1990-1992年及2004-2005年我国肝癌死亡分别位居全部恶性肿瘤死因顺位的第3、2、和2位(张思维等：中国肝癌发病的趋势分析和预测.《中华预防医学杂志》，2012，46(7)：588-592)。未来很长一段时间肝癌仍将是危害国内各大群众主要恶性肿瘤。阿霉素是传统的用于肝癌治疗的药物，但缓解率仅为10-15％且不能延长患者的生存时间。近年来，随着分子生物学、基因组学及蛋白质组学的进展，陆续问世了一系列的分子靶向药物可以用于肝癌的救治。分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子为靶点，选择针对性的阻断剂，可有效地干预该标志性分子调控和密切相关的信号传导通路，从而达到抑制肿瘤生长、进展及转移的效果。相对于手术、放疗、化疗三大传统治疗手段，其具有较好的分子选择性，能高效并选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。分子靶向药物的选择性高，广谱有效，不易发生耐药，同时安全性优于细胞毒性化疗药物，是目前肿瘤治疗领域发展的新方向。目前，针对肝癌靶向治疗的主要研究有：以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的肝癌治疗研究，目前主要包括大分子的单克隆抗体(如西妥昔单抗、尼妥珠单抗)和小分子的化合物如吉非替尼、厄罗替尼等药物；以抗血管生成为靶点的肝癌治疗研究，VEGF单克隆抗体Becacizumab；多激酶抑制剂索拉非尼对原发性肝癌的治疗研究；以肝细胞生长因子及其受体为靶点的肝癌治疗研究等。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白。glypican-3蛋白通过硫酸乙酰肝素葡萄糖胺聚糖链连接于核心蛋白，核心蛋白羧基末端通过GPI锚定于细胞膜表面。glypican-3与肝癌、黑素瘤及卵巢透明细胞癌的发生和发展密切相关。GPC3表达具有较高的特异性，在肝癌中高表达，在黑素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、成神经细胞瘤、肝母细胞瘤和Wilm肉瘤细胞等肿瘤中少量表达，而在乳腺癌、间皮瘤、卵巢上皮癌和肺癌中则不表达表达，在正常人组织中几乎不表达，因此其有望成为肝癌免疫治疗的理想靶点之一(阮健等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在恶性肿瘤中的表达及其临床应用.肿瘤，2011，31(9)：863-866)。目前，共有4个glypican-3抗体进入不同的研究阶段。GC33(IshiguroT，etal.Anti-glypican3antibodyasapotentialantitumoragentforhumanlivercancer.CancerRes.2008；68(23)：9832-9838.NakanoK，etal.Generationofahumanizedanti-glypican3antibodybyCDRgraftingandstabilityoptimization.AnticancerDrugs.2010；21(10)：907-916)为第一个进入临床研究的人源化抗体。GC33为对鼠源性母本抗体进行人源化改造后得到的抗体，GC33识别glypican-3的羧基端(542-563)的多肽表位，主要通过抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)以及募集肿瘤肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)发挥抗肿瘤作用。目前完成与索拉非尼(sorafenib)联合用药的I期临床研究(NCT00976170)，II期临床研究患者正在招募中(NCT01507168)。YP7为高亲和力人源化抗体(PhungY，GaoW，ManYG，NagataS，HoM.High-affinitymonoclonalantibodiestocellsurfacetumorantigenglypican-3generatedthroughacombinationofpeptideimmunizationandflowcytometryscreening.MAbs.2012Sep-Oct；4(5)：592-9)，YP7与glypican-3的亲和力的KD为0.3nM，识别glypican-3的羧基端(510-560)的多肽表位。具有较强的肿瘤抑制活性。HN3为人源单域抗体(FengM，etal.Therapeuticallytargetingglypican-3viaaconformation-specificsingle-domainantibodyinhepatocellularcarcinoma.ProcNatlAcadSciUSA.2013；110(12)：E1083-1091.)。该抗体可直接抑制HCC细胞的增殖。该抗体是通过噬菌体抗体库技术筛选得到。HN3高亲和性结合glypican-3的核心蛋白部位。在体内、体外均对glypican-3阳性肝癌细胞有很好的抑制作用。HN3的独特性在于它可直接抑制肿瘤细胞的增殖，参与YAP信号通路，使细胞周期阻滞。MDX-1414为全人源抗体(FengM，HoM.Glypican-3antibodies：anewtherapeutictargetforlivercancer.FEBSLett.2014Jan21；588(2)：377-82.)。MDX-1414由Medarex公司从多株全人源抗体中筛选得到，具有亲和力高，特异性强，有内在化特性，体内外研究显示有较好的抑制肿瘤细胞生长的作用，且无明显的毒副作用。目前还处于临床前研究阶段。