[发明专利]一种用于基因表达量调节的寡核苷酸片段库及其应用

权利要求书

1.一个寡核苷酸片段库MLrbSSRs，其特征在于，库容量为1×10⁴，命名为MLrbSSRs。基于四种简单的重复序列(A)₈，(AC)₆，(AT)₆，(C)₈，通过PCR引入突变的方式得到。

2.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是携带有完整蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp.7120碳酸酐酶基因(ecaA)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc)的pTrchisB载体(pTrc-CP)。

3.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求1中的特殊寡核苷酸片段通过大引物PCR的方式插入权利要求2中的质粒pTrc-CP，中而得到的(pTrc-CPO)。

4.一种重组质粒，其特征在于，通过MLrbSSRs调节了基因表达量：ecaA基因表达量为对照组的3.53倍，pepc基因表达量为对照组的1.06倍(pTrc-CPO)。

5.一种琥珀酸高产基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过将权利要求1-5中任一项的重组质粒转入原始菌株大肠杆菌ML1515中而得到的。

6.权利要求1的寡核苷酸片段库MLrbSSRs的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先构建8种母体质粒，再采用易错PCR方式，得到库容量大为提高的含有(A)_n，(AC)_n，(AT)_n与(C)_n的片段库。所有产物与经过BamHI和HindIII进行双酶切的pTrchisB连接，得到所述重组寡核苷酸片段库。

7.权利要求2的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

以蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp.7120的全基因组为模板，进行PCR扩增，得到长度分别约为795bp和2962bp的片段，经测序证实两片段分别为碳酸酐酶基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的编码序列，连接到pTrchisB载体，得到质粒pTrc-CP。

8.权利要求3的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括，从权利要求1中选择合适的寡核苷酸片段，采用大引物PCR的方法插入权利要求7方法得到的质粒上，对CA酶和PEPC酶的酶活进行优化，构建出所述重组质粒。

9.权利要求5的琥珀酸高产基因工程菌的制备方法，其特征在于，权利要求2-4中任一项的重组质粒转入原始菌株大肠杆菌ML1515中，即得到所述基因工程菌。

10.权利要求1的寡核苷酸片段库在其它工程菌中多基因表达量的调节上的应用，其特征在于：生产任何其它化工产品和医药产品时，包括乳酸，乙醇，氨基己酸，己二酸和许多医药中间体，在需要表达多个外源基因的时候，采用权利要求1的寡核苷酸片段库进行基因表达量的协调和优化。

11.权利要求2-5中任一项的重组质粒及工程菌在制备用于基因工程菌发酵生产琥珀酸的生物产品中的应用。