[发明专利]一种荷花再生体系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，涉及一种荷花再生体系的构建方法。

背景技术

荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)为莲科莲属多年生水生花卉,是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值、经济价值和独特的文化内涵，深受人们喜爱。

2013年5月，荷花的全基因组序列公布，将荷花的转基因研究提上了工作日程。而作为转基因重要技术基础的荷花的遗传转化再生体系尚不成熟，严重制约了荷花转基因工作的开展。目前报道的荷花再生的途径有两种，一种途径是由茎尖直接分化形成丛生苗，然后进行增殖，最后诱导生根获得完整植株(于文进，1997；彭静，2001；汤泳萍，2001；刘玫，2002)，但尚未见该再生途径转基因方面的报道。另一种途径是用荷花成熟胚培养出无菌苗，再用无菌苗的茎尖作为外植体诱导出愈伤，然后对愈伤组织诱导不定芽分化，最后生根成苗。

关于用荷花成熟胚进行无菌苗培养时取莲胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等人(2013)使用浓硫酸腐蚀莲子种皮，用小刀破壳后直接用酒精和氯化汞消毒，由于硫酸渗透对外植体造成伤害，成活率最高仅86.63％。孔德政等人(2007)研究发现，对用浓硫酸腐蚀莲子壳获得的种胚进行直接灭菌时间太短则污染率高，时间延长则致死率高。本发明通过实验总结出了用带壳莲子消毒，再破壳取成熟莲胚进行培养的方法，操作简单，死亡率极低，大大降低了污染率(除内生菌外鲜有污染)，褐化率极低，成活率高达98％以上。

发明内容

本发明的目的是提供一种荷花再生体系的高效构建方法，为中国荷花的转基因技术提供重要的技术基础。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种荷花再生体系的构建方法，包括以下步骤：

(1)灭菌：选取‘广昌白莲’的圆形饱满的带壳莲子用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；

(2)无菌苗的培养：将莲子较圆的一端用无菌修枝剪横剪一下使莲心(胚)露出，然后用镊子取出莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中,每天光照时间为14-16小时，光照强度控制在1500-2500Lx，温度控制在25-28℃；

(3)愈伤组织诱导：从无菌苗上切取2-3mm的茎尖或带有1mm的叶柄未展开的整片幼嫩叶片作为外植体，接种到愈伤培养基上培养，接种时使切口处完全与培养基相接，每个培养基接种5-6个，在黑暗条件下培养，每30天更换新鲜培养基，培养2个月后获得愈伤组织；

(4)不定芽分化诱导与增殖：将叶片和茎尖的愈伤组织接到不定芽诱导培养基上，每天光照时间为14小时，光照强度1500-2500Lx，一个月后分化苗长至1cm时切去下面死去的黑色愈伤，并将分化苗转移至增殖培养基，培养三个月，每30天更换新鲜培养基；

(5)分化苗的生根：将分化苗从增殖培养基转移到生根培养基内，每天光照时间为14小时，光照强度1500-2500Lx，一个月后待小苗长出根后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化；

(6)组培苗的炼苗驯化与移栽：将生了根的小苗洗净后，用0.8-1g/L代森锰锌浸泡半小时，栽至装有灭菌淤泥的塑料盆中，遮阴并覆盖薄膜保湿，4天后昼覆夜敞，15天后完全除掉薄膜；其中，使用的培养基配方如下：

无菌苗培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.8，

愈伤诱导培养基：MS+TDZ 0.1-0.2mg/L+NAA 0.7-0.8mg/L+蔗糖50g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，不定芽诱导培养基：MS+6-BA 50μM+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6,

增殖培养基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，

生根培养基：MS+IBA 1-2mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6。

步骤(1)灭菌的具体方法优选：选取“广昌白莲”的圆形饱满的种子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，备用。

步骤(2)中每天光照时间优选14h，光照强度1500-2500Lx，控温优选25℃。

步骤(6)中代森锰锌浓度优选1g/L。

步骤(4)中所述的不定芽诱导培养基优选：MS+6-BA 50μM+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6。

本发明的有益效果：