[发明专利]一种提高拟南芥抗虫能力的方法

权利要求书

1.一种提高拟南芥抗虫能力的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)以质粒pBI121LeTD2为模版，利用引物LeTD2_F和LeTD2_R，通过PCR得到目的片段LeTD2长度1788bp；将目的片段克隆到带有除草剂抗性筛选标记基因Bar的安全载体pBA002的AscI和XbaI之间；

(2)以质粒pNIGEL07为模版，利用引物TUBQ10_F-EcoRI和TUBQ10_R-PstI，通过PCR扩增获得终止子TUBQ10；PCR产物和载体pGreenII0229分别用EcoRI和PstI酶切，凝胶电泳回收，进行连接，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，然后进行筛选鉴定；阳性克隆进行测序测定，得到正确克隆命名为pG29TUQ10；

(3)以质粒pBI121LeTD2为模版，利用引物LeTD2_F-XhoI和LeTD2_R，通过PCR获得LeTD2cDNA片段长度1788bp，并将该片段连入步骤(2)得到的pG29TUQ10的多克隆位点XhoI和EcoRV之间，转化筛选并经酶切鉴定获得了阳性克隆pLeTD2TU；阳性克隆送去测序，序列测定结果显示所得到的构建为正确的构建；

(4)由于没有合适的酶切位点，所以采用同源重组的方法将p35S-LeARG2-T35S片段克隆到上述步骤(3)构建的pLeTD2TU中；按照重组克隆试剂盒的说明设计扩增引物LeARG2-F-SmaI和LeARG2-R-SacI，利用引物LeARG2-F-SmaI和LeARG2-R-SacI，以pB2GW7LeARG2为模版扩增p35S-LeARG2-T35S片段；用SacI和SmaI双酶切载体pLeTD2TU，使载体线性化；利用CloneEZ重组酶将线性化的载体pLeTD2TU与PCR扩增好的p35S-LeARG2-T35S进行同源重组反应，然后转化大肠杆菌DH5感受态细胞；筛选鉴定得到阳性克隆pLeARG2-TD2-TU；阳性克隆送去测序，序列测定结果显示所得到的构建为正确的构建；质粒pLeARG2-TD2-TU的PCR检测所用引物为35s-F和LeARG2-574R，扩增出的片段为p35S-LeARG2-T35S上的部分序列；

(5)以质粒pNIGEL07为模版，利用引物pUBQ10_F-KpnI和pUBQ10_R-XhoI，通过PCR扩增获得启动子pUBQ10；将pUBQ10克隆到步骤(4)得到的pLeARG2-TD2-TU的多克隆位点KpnI和XhoI之间，得到含有精氨酸酶和苏氨酸脱氨酶的安全转化载体pLeARG2-TD2，筛选到的克隆经酶切鉴定为阳性克隆；阳性克隆送去测序，序列测定结果显示所得到的构建为正确的构建；

(6)将上述步骤(5)得到的载体与质粒pBA002LeTD2和pB2GW7LeARG2转入农杆菌C₅₈C₁中，通过花苞浸泡法，将抗虫基因LeARG2、LeTD2、LeARG2-TD2分别转入野生型拟南芥Col-0中，获得提高拟南芥抗虫能力的转基因苗。