[发明专利]一种重组猪伪狂犬病毒gE/gI双基因缺失株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于家畜疫苗制备技术领域，具体涉及一种重组猪伪狂犬病毒 gE/gI双基因缺失株及其应用。

背景技术

猪伪狂犬病病毒PRV(Pseudorabies virus)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病(Pseudorabies,PR)。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前尚无治疗PR的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。世界上使用最广泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状为现有该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击，给免疫猪场造成了一定的经济损失。因此，需要提供最新流行毒株制备的疫苗就成为猪伪狂犬病病毒病防治领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪伪狂犬病毒gE/gI双基因缺失株及其应用，即由筛选出的猪伪狂犬病病毒的基因缺失株作为抗原制备的疫苗，本发明的疫苗对目前流行的猪伪狂犬病病毒的攻击能够提供良好的免疫保护效力。

本发明首先提供一种猪伪狂犬病毒基因缺失株，是由保藏编号为 CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒株进行gE和gI基因缺失后制成的。

本发明另一个方面提供上述猪伪狂犬病毒基因缺失株在制备疫苗中的应用；

本发明再一个方面提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有上述的猪伪狂犬病毒基因缺失株。

其中的保护剂为目前使用的病毒疫苗用保护剂，其一种实施例具体成分为蔗糖和明胶的水溶液，其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为20％和 4.8％。

上述的疫苗中加入了抗生素，青霉素、链霉素终浓度为200单位/ml；

本发明制备的疫苗可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，通过水平传播感染在小鼠体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域的普通技术人员在本发明技术方案的基础上，可以选用本领域常用的方法步骤，而不仅限于本发明说明书实施例的具体记载。

实施例1：CGMCC No.10266猪伪狂犬病病毒株的选育

近年来，我国多个猪场都发生了伪狂犬病，其中大部分是种猪场，而发病猪群之前已经注射了伪狂犬疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病猪群中进行了猪伪狂犬病毒的筛选。

取发病猪内脏样本，包括：心脏、肝脏、肺脏、脾脏、扁桃体和淋巴结等。将内脏样本与PBS(0.1M,pH7.2)以V/V1:5制成匀浆，反复冻融3 次，3000r/min离心15min，取上清中加双抗，37℃感作1h，经0.22μm滤膜过滤除菌。取1ml病毒滤液接种于长成单层的Vero细胞，盲传三代，观察细胞病变(CPE)。将出现CPE的细胞培养液进行空斑纯化，纯化后的病毒分装保存至-70℃备用，并测定病毒含量。选取作为疫苗研制的猪伪狂犬病病毒QD株(疱疹病毒Ⅰ型Porcine herpesvirus Type Ⅰ)已于2015 年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.10266。

对于本发明筛选的毒株进行PCR检测，测序后进行blast分析，发现保藏编号为CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒的gE基因与2012年之后报道的猪伪狂犬病病毒的相对应的序列虽然存在至少2个氨基酸的差异，但是亲缘关系较近，均处于一个相对独立的分支中，与之前分离的毒株亲缘关系较远。且与最近分离的毒株具有相同的分子特征，即在gE基因第48位和第492-496位各有1个天冬氨酸的插入，其他报道也证实也这一点。而以前分离到的毒株只个别有一个位置插入氨基酸，绝大部分没有插入。因此可以推测上述的差异正是导致已有的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。