[发明专利]一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法

说明书

本发明公开了一种应用BLU‑V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法。根据GenBank已公布Map的（登录号：AF286339）ISMAV2基因组序列，选取该基因的保守序列，设计TaqMan荧光探针及引物。将BLU‑V系统作为光源应用于PMA技术中结合荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中MAP活菌的方法。该方法操作简单，快速且比较精确。

技术领域

本发明一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术

副结核病（Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌，即鸟分枝杆菌副结核亚种（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis,MAP）引起的一种以反刍动物为主的慢性消耗性传染病，也称Johne,s病。该病很难净化，而且与人类的克罗恩氏（Crohn,s）病存在潜在的联系，有研究表明人的这种严重的疾病可能是由于奶的巴氏消毒法不能够完全杀灭该菌，且研究中发现几乎44%的奶制品中都检出副结核菌为阳性。随着我国国民生活水平的不断提高，牛奶需求量呈正指数增长，急需大量的优质、高产奶牛，促使近年来进口种牛骤增，迫切需要建立早期的快速、准确的副结核病诊断方法，以预防、净化和根除该病，保护我国畜牧业的健康快速发展。

目前检测副结核分枝杆菌的常见方法有细菌学诊断、免疫学诊断、分子生物学诊断。其中涂片镜检法不能鉴别出感染者体内的病原菌是否存活，细菌培养法存在难于培养且耗时长至少4-6周，药敏试验也耗时比较长的问题。补体结合实验（CF）虽然对有临床症状的病畜检出率较高，但用于潜伏感染病例时效果不佳。琼脂扩散试验（AGID）方法敏感性低，不宜用作筛选和鉴定亚临床感染病例。酶联免疫吸附试验（ELISA）比较敏感，有希望作为常用的诊断法。近几年，Nogva等人应用EMA-PCR技术来区分活菌和死菌。但是EMA具有一定的毒性，如果与细胞作用时间稍长就会嵌入活细胞的细胞膜与其DNA结合，从而影响，检测结果。单叠氮丙啶（propidium mono azide,PMA）能够通过细胞膜破损的死菌， 与 DNA 结合，使死菌 DNA 在 PCR 时不再扩增， 进而检测活菌的信号。Tomas Garcıa-Cayuela[53]等利用PMA-qPCR方法对乳制品中的四种乳酸菌进行了定量检测，PMA-PCR技术是目前最具应用前景的活菌检测技术。目前未有人应用BLU-V PMA结合荧光定量PCR技术进行副结核分支杆菌的存活性的快速判定。

然而，光源类型也是影响PMA处理的一个重要因素，在以往实验中对PMA进行处理时，所使用的光源都是600W的卤素灯，虽然其造价合理，照明度充分，但是它达到峰值亮度的时间短，且受到空气介质和样品浊度的影响，都会使PMA的处理效果降低，导致试验出现假阳性和假阴性的结果。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术中，结合荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中MAP活菌的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术中；

所述的将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法包括如下步骤：

a取待测样品，液体样品直接离心，固体样品加蒸馏水溶解离心，14500r离心5min；离心完毕后，弃去上清，加入EBBuffer于沉淀中，混匀得菌悬液；