[发明专利]一种pH释放型免疫传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种pH释放型免疫传感器的制备方法及应用。具体是将氧化还原探针硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，利用硫堇的氧化还原特性来对肿瘤标志物进行检测，制备一种检测肿瘤标志物的释放型免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

目前电化学免疫传感器已经广泛应用于肿瘤标志物的检测，释放型免疫传感器是一种比较新颖的检测肿瘤标志物的方法，因此受到更加广泛的关注。

近年来，介孔硅材料由于其具有较大的比表面积，较高的孔容和可调节的孔径，受到了吸附、传感等领域的广泛关注。因此，利用其具有良好的吸附性能来对硫堇进行吸附，并用羧基功能化金Au-COOH对其孔道进行封闭，使得硫堇稳定在介孔二氧化硅的孔道内，介孔二氧化硅-Au作为传感器制作中的检测抗体标记物，制得检测肿瘤标志物的免疫传感器，利用pH控制孔道的开和关，来达到检测的目的。

发明内容

 本发明的目的之一是制备一种pH释放型免疫传感器。

 本发明的目的之二是将该pH释放型免疫传感器应用于肿瘤标志物的检测。

本发明的技术方案

1．一种pH释放型免疫传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；

（2）取6 μL、0.5~3 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干；

（3）滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4℃下晾干，超纯水冲洗；

所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为1~4 : 1；

（4）用3 μL、质量分数为0.5~1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4℃下晾干，超纯水冲洗；

（5）将6 μL的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，超纯水冲洗；

（6）继续滴加4~6 μL检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器；

2．检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备

（1）介孔二氧化硅的制备

将0.3~0.7 g的CTAB溶于200 mL的超纯水中，加入1~2 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80℃回流反应20 min，随后加入1.5~3.0 mL的四乙氧基硅烷，继续反应2 h生成白色沉淀，为了去除溶液中残留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、质量分数为37%的HCl和75~100 mL的甲醇的混合液中，80℃下回流10~12 h，将混合物离心，经水和甲醇洗涤数次，35~45℃下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒径大小为100 nm左右，孔径大小为5 nm左右；

（2）缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制备

将0.1~0.3 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入0.2~1 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80℃回流反应12 h，混合物经离心、洗涤、45℃下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；

将0.1~0.3 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亚砜溶液中，随后加入50~100 mg丁二酸酐和50~100 mg三乙胺，40℃下反应48 h，得到的固体经乙醇洗涤，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅；

分别将20~80 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和10~30 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于3 mL超纯水中，加入50~100 mg羧基化的介孔二氧化硅，80~130 mg的3,9-双(3-氨丙基)-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷，室温下搅拌8 h，沉淀经洗涤干燥得到缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal；

（3）羧基功能化金Au-COOH的制备