[发明专利]草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于果树病害防治及植物检疫技术领域，涉及草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用。

背景技术

草莓根腐病是由土传病原真菌共同引起的一大类病害总称。世界范围内草莓主产区已报道的根腐病病原物达20余种，是一种较难防治的土传病害。常见的病原菌有：引起草莓黑根腐病的主要有镰刀菌(Fusarium spp.)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、腐霉菌(Pythium sp.)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis sp.)；引起草莓红中柱根腐病的病原菌为疫霉菌(Phytophthorafragariae C.J.Hickman)。草莓根腐病典型症状是切开病根或剥下根外表皮可看到暗红色病组织，与健康部位形成鲜明对照；地下部发病迅速，地上部分突然凋萎，全株青枯死亡。根腐病发病率为20％～30％，个别地区达到50～80％，发病植株死亡率100％。近年来草莓黑根腐及红中柱根腐在草莓病害中的危害最重、影响最大，严重影响草莓的产量和效益，成为草莓种植发展的瓶颈问题。

引起草莓根腐病的病原真菌具有明显的潜伏侵染的特征。在草莓上根腐病菌的潜伏侵染是很普遍的现象，当环境条件适合发病时，就会发生草莓根腐病。草莓生产中一般使用无性种苗繁殖，各地区间种苗的流动性也很频繁。如果移栽的种苗上有根腐病原菌的潜伏侵染，往往会引起病原菌的跨地区长距离传播，造成根腐病区域性暴发，给草莓生产带来巨大经济损失。因此，用无根腐病发生的育苗基地繁殖的无菌种苗可以从根源上避免草莓根腐病的发生。但随着种植面积扩大，加上病害传播范围越来越广泛，这种方法难度很大。因此建立有效的种苗检测技术是非常重要的，可以有效避免草莓根腐病的传播与发生。但是由于带菌种苗不显症，而且目前发展的一些检验方法因为繁琐耗时不容易推广实施，还是给当前根腐病菌检验带来了极大难度。草莓根腐病的病因复杂，化学防治方法合理使用前提就是要搞清楚本地区草莓根腐病的病原微生物种类，对症下药才能起到事半功倍效果。同时，化学防治带来的残留问题和对生态环境的破坏已经不容忽视。传统的病原菌分离培养鉴定的方法又依赖于专业人员丰富的经验和系统的病原菌分类的理论知识，这样就会贻误最佳的防治时机。目前，防治草莓根腐病还没有行之有效的方法。主要是采取以农业防治为主，化学防治为辅的综合治理措施。因此，对草莓根腐病应以预防为主，着重加强对该病害的检疫检测。为防止草莓根腐病从疫区传入非疫区，确保国内草莓的安全生产，建立一套稳定、简便、快速、灵敏的分子检测方法对草莓种苗进行检疫检测是非常必要的。PCR检测方法具有灵敏度高、精度高、取样量微小、检测时间短等优点。通过该技术对草莓种苗等定性检测，为确保我国草莓无病种苗生产基地的建设、安全生产，同时堵截国外危险性带病草莓种苗传入我国具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的存在的缺陷，提供一种草莓根腐病害病原菌分子快速检测方法。该方法操作简便易行，直接应用于生产实践，用于带菌植物组织的高灵敏度快速检测，确保为生产提供健康无菌种苗、对病原菌分子预警具有十分重要的意义。

本发明的另一目的在于提供所述草莓根腐病病原菌分子快速检测方法的应用。

其具体技术方案为：

草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法，包括以下步骤：

步骤1.病原菌的分离

采用组织分离法对草莓根部的病原菌进行分离，切取病健交界处的病组织4-5mm的小块，置于75％乙醇中浸泡5s，接着将病组织移入0.1％升汞溶液中浸泡3-5min，再将病组织转移到无菌水中漂洗3遍，最后将组织移到PDA培养基上，将培养皿放置25℃培养箱中培养3-5d，菌落直径1cm即进行DNA提取实验；

步骤2.病原菌DNA少量提取

1)用灭菌牙签刮取PDA平板上的少量病原菌菌丝，装入2.0ml的离心管中；

2)加入500μl Lysis buffer，1颗破碎珠，多样品组织研磨机研磨60-90s；

3)室温静置10min；

4)13200rpm，室温离心10min，取上清液400μl转入新离心管中；

5)加入800μl无水乙醇，颠倒混匀；-20℃静置10min沉淀DNA；

6)13200rpm，4℃离心5min；