[发明专利]一种三氯生人工抗原及其合成方法和抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明属于有机合成、免疫化学及生物化学领域，涉及三氯生人工抗原及其合成方法和抗体的制备。

背景技术

三氯生（Triclosan，TCS）是目前广泛使用的广谱高效抗菌剂，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母及病毒以及对抗抗生素菌、非抗抗生素菌均有广泛高效的杀灭及抑制作用，广泛应用于家庭与个人护理产品中，如牙膏、洗面奶、洗发剂、肥皂等，结构式如下：

。

TCS最初一直被认为是安全、无毒的，然而近年来牙膏中TCS致癌引起热议，同时美国食品药品监督管理局重启对TCS安全性的评估，使得TCS再次引起广泛的关注；研究表明TCS可以通过生活污水进入环境水体，随着人类日用品使用量的急剧上升和分析检测手段的不断提高，在污泥、地表水和生活污水中均有TCS检出的报道，在污水处理厂附近的藻类、软体动物等水生生物体内有TCS及其代谢物甲基TCS检出，甚至在人类母乳中也发现有TCS残留，TCS在水体环境中大量存在，使得TCS的生态风险日益受到关注。

目前现有的三氯生检测方法主要采用高效液相色谱法、高效液相色谱、GC-MS法、分光光度法等，但这些仪器分析方法存在仪器昂贵、操作复杂、对操作人员要求高等弊端；免疫分析方法因其快速、操作简单、灵敏度高等优势，已成为有毒有害残留物快速检测的主要方法之一，而免疫分析方法建立的前提是获得高亲和力和高灵敏度的抗体，而小分子半抗原结构的设计又直接影响相应抗体的特性，因此设计并合成小分子半抗原并制备相应的抗体是建立免疫分析方法的基础。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种三氯生半抗原化合物。

本发明的第二个目的在于提供一种由上述半抗原化合物制备而来的人工抗原化合物。

本发明的第三个目的在于提供一种操作简单的三氯生半抗原化合物和三氯生人工抗原的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供一种效价高、特异性识别三氯生的多克隆抗体。

本发明的技术方案：

本发明提供了一种三氯生半抗原化合物，如化合物Ⅰ所示；化合物Ⅰ既最大程度的保留了TCS的特征结构，又具有可以和大分子物质偶联的活性基团。

化合物Ⅰ。

本发明还提供了一种三氯生人工抗原化合物，如化合物Ⅱ所示。

化合物Ⅱ。

所述蛋白为大分子蛋白，具体为：牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA、牛甲状腺球蛋白BTG和血匙蓝蛋白KLH中的一种。

一种三氯生人工抗原的合成方法，三氯生和丁二酸酐按1:1.2的摩尔比溶于吡啶中，加入的吡啶与三氯生的体积摩尔比为2:1，于80℃水浴搅拌48小时；用旋转蒸发仪除去吡啶，加入与吡啶同体积的双蒸水，用吡啶5倍体积的乙酸乙酯萃取3次，再用吡啶5倍体积水洗乙酸乙酯相3次，用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得到合成三氯生半抗原即化合物Ⅰ，化合物Ⅰ通过碳二酰亚胺（EDC）活化后，与大分子蛋白偶联，获得三氯生人工抗原，即化合物Ⅱ，合成路线如反应式（1）所示：

反应式（1）

合成方法为：

（1）三氯生半抗原的制备

三氯生和丁二酸酐按1:1.2的摩尔比溶于吡啶中，吡啶与三氯生的体积摩尔比为2:1，于80℃水浴搅拌48小时；用旋转蒸发仪除去吡啶，加入与吡啶同体积的双蒸水，用吡啶5倍体积的乙酸乙酯萃取3次，再用吡啶5倍体积水洗乙酸乙酯相3次，用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得到合成三氯生半抗原即化合物Ⅰ。

（2）三氯生人工抗原的制备

取化合物Ⅰ溶于DMF，每100μL的DMF中溶解10mg化合物Ⅰ，加入与化合物Ⅰ同质量的EDC，室温搅拌30分钟，蛋白溶解于0.01MpH7.4的PBS缓冲液中，每2mLPBS溶解100mg蛋白；将蛋白溶液加入到化合物与EDC混合溶液中，蛋白与化合物Ⅰ的质量比为5:1；室温搅拌过夜，取出装入透析袋，用0.01MpH7.4PBS缓冲液透析三天三夜，其中换液6-8次；PBS透析后得到化合物Ⅱ。

所述大分子蛋白为：牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA、牛甲状腺球蛋白BTG、血匙蓝蛋白KLH中的一种。

本发明还提供了一种利用上述三氯生人工抗原制备特异性抗体的方法。