[发明专利]简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法在审

专利信息
申请号: 201510252004.3 申请日: 2015-05-18
公开(公告)号: CN104789523A 公开(公告)日: 2015-07-22
发明(设计)人: 刘红波;吕培茹;高方方;王晓晶;崔利芳;王彦涛;胡莲 申请(专利权)人: 河南省格林金斯生物科技有限公司
主分类号: C12N5/075 分类号: C12N5/075;C12N15/877;A01K67/027
代理公司: 郑州金成知识产权事务所(普通合伙) 41121 代理人: 郭乃凤
地址: 450001 河南省郑*** 国省代码: 河南;41
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摘要:
搜索关键词: 简便 高效 低耗 猪卵母 细胞 体外 成熟 克隆 培育 方法
【说明书】:

技术领域:

发明涉及一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法,属于细胞生物学技术领域。

背景技术:

传统的动物卵母细胞体外成熟体系依赖于C02培养箱和细胞培养皿、培养板、石蜡油等耗材,基本上都依赖进口,价格昂贵,实验结果的稳定严重依赖经过严格训练有素的技术人员。进行胚胎工程技术的大规模工程化生产,要求必须建立操作简便、便宜、可操作性较强的技术体系。通过本发明研究,成功建立了卵母细胞3-D摇床成熟体系,很好的解决了服务于胚胎工厂化生产的卵母细胞体外成熟的问题,必将对相关胚胎工程技术的应用产生巨大的推动和促进作用。

发明内容:

本发明所要解决的技术问题是:提供一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法,经3-D摇床成熟的卵母细胞获得的猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70% 。

本发明为解决就技术问题所采取的技术方案是:

一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法,其具体操作步骤如下:

①收集猪卵巢:从屠宰场收集普通商品猪卵巢,置于 30~37 ℃的0.9%生理盐水中,5 h内运回实验室 ,并用生理盐水冲洗3~5 次;

②挑选卵母细胞:用带 12 号针头的 10 ml注射器抽取卵巢表面上直径为 2~6 ml 卵泡的卵母细胞 ,然后在实体显微镜下用胚胎移液器吸取带有2层卵丘细胞以上、胞质均匀的卵母细胞,在洗卵液中洗3 次,再在成熟液中洗 2次;

③卵母细胞成熟:将挑选好的卵母细胞放入含有卵母细胞成熟液的离心管中,用3-D摇床成熟45 h ,培养条件为39 ℃;

④供体细胞分离培养:无菌获取成年猪耳部组织样本,并于低温条件下及时运送到实验室;将其剪碎离心洗涤后,加入适量供体细胞培养液,并将组织碎块接种到培养瓶中;待供体细胞爬出并长到70~80%汇合度时,进行传代培养或冷冻保存;

⑤挑选成熟卵母细胞:将成熟42~46 h的猪卵母细胞在0.1~0.3 %的透明质酸酶中涡旋震荡,去除卵丘细胞,挑选排出第一极体的成熟卵母细胞,通过盲吸去核法进行去核;

⑥克隆胚胎构建:吸取中等大小、圆形、细胞膜折光度较好的供体细胞注射到透明带下方,并轻点透明带使供体细胞与去核的卵母细胞细胞膜良好接触,形成重构卵;

⑦克隆胚胎培养:将重构卵在洗涤液中洗涤3遍后,分批移到融合槽的融合液中进行融合;将融合过的重构胚,分批移入激活液中激活3h,然后再移入胚胎培养液中,在39℃的培养箱中培养直至移植;

⑧克隆胚胎移植:选用自然发情或诱导发情的母猪作为受体母猪,发情当天至第2天手术进行克隆胚胎移植,手术前停喂饲料12h;将培养好的克隆胚胎置入37℃的便携式培养箱中带入猪场手术室;

⑨克隆胚胎移植后28~30天通过B超检查受体母猪怀孕情况。

在步骤③中,所述的卵母细胞成熟液为10%的卵泡液 + 1μg/ml 的促卵泡素FSH + 1μg/ml的促黄体素LH + 5.9g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes + 5-15mM 的NaHCO3  + 10~20 ng/ml的表皮细胞生长因子EGF + 0.57mM的半胱氨酸L-Cysteine + 75 μg/ml 的青霉素 + 50 μg/ml 的链霉素 + 2~8 mM 的维他命BT + 20 μM 的维他命E 。

在步骤④中,所述的供体细胞培养液为 66 mg/L的青霉素 + 100 mg/L的硫酸链霉素 + 10~15%的胎牛血清FBS 。

在步骤⑤中,所述盲吸去核法如下:用固定针固定卵母细胞,用外径为18~20μm的去核针吸取第一极体及其周围的少量细胞质,然后用去核针轻压透明带切口再挤出些许胞质;或用5~10μg/ml的Hoechest 33342(一种活细胞染料,其与细胞DNA可逆性结合,在紫外光照射下,可以发出荧光)染色15~20min后,在紫外光下直接对卵母细胞进行去核处理。

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