[发明专利]除皱短肽及其制备方法

权利要求书

1.一种除皱短肽rE14的制备方法，其特征在于：所述除皱短肽rE14的氨基酸序列为：Gly-Pro-Glu-Glu- Met-Gln-Arg-Arg-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，表示利用大肠杆菌发酵的工艺重组表达的除皱短肽，其制备方法包括如下步骤：

（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建：

1.1、设计Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg的氨基酸序列为基本重复单元pL14构建蛋白序列pL14-n，其中n为1-100的任意数值；

1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列L14-n，即（ctggaggtgctgtttcagggtccggaagagatgcagcgtcgc）n；

1.3、将核苷酸序列L14-n克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养：

2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于LB培养基中35～38℃培养过夜；

2.2、将菌液接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL14-n，离心收集菌体；

（3）重组除皱短肽rE14的纯化：

3.1、用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；

3.2、在谷胱甘肽亲和柱上加入Prescission Protease蛋白酶，利用谷胱甘肽亲和柱从上清液中纯化得到除皱短肽rE14。

2.根据权利要求1所述的除皱短肽rE14的制备方法，其特征在于：步骤1.1和1.2中，n=9。

3.根据权利要求1所述的除皱短肽rE14的制备方法，其特征在于：步骤1.3具体为，设计上下游引物，将引物和核苷酸序列进行PCR步骤，回收目的基因，用Bam I和Xho I将核苷酸序列切成粘性末端，同样处理pGEX-6p-1载体，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序列分析含有正确的基因序列阅读框架，成功构建pGEX-6p-nL14-9表达载体；将pGEX-6p-nL14-9表达载体，转化BL21菌。

4.根据权利要求1所述的除皱短肽rE14的制备方法，其特征在于：步骤2.2具体为，将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入0.5mM IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。

5.根据权利要求1所述的除皱短肽rE14的制备方法，其特征在于：步骤3.1具体为，用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用Tris缓冲液重悬菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，在冰水混合物环境下超声破菌，12000rpm/min离心20min，收集上清液，此时溶液中即含有大量的GST-pL14-9重组蛋白；

步骤3.2具体为，用PBS缓冲液清洗谷胱甘肽亲和柱，然后将柱材和破菌上清混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用含有1M NaCl的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的GST-pL14-9重组蛋白；在柱上加入Prescission Protease蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将除皱短肽rE14从谷胱甘肽亲和柱上释放出来。