[发明专利]一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法。

背景技术

基因干扰是研究植物基因功能的一个重要手段，干涉正常核糖核酸的积累(RNAi)是基因干扰的一个方法。RNAi是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉寂，抑制或者阻断基因表达。小干扰RNA(siRNA)是由dsRNA经过剪切形成的21-25核苷酸(nt)，是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。使用转基因植物表达dsRNA，表达的dsRNA可以由Dicer和Rde-1作用形成靶标siRNA池。

检测转基因植物中靶标siRNA池的形成对于研究目标基因的干扰过程具有重要意义。目前，检测转基因植物中靶标siRNA池的方法主要有两种：1.利用含有放射性磷³²P-dCTP的DNA探针；2.检测靶标siRNA可以使用合成小片段反义单链RNA(ssRNA)(通常小于30nt)，然后使用化学修饰的方法，在ssRNA的5’或者3’端增加地高辛(DIG)标记。但是，这两种方法的实施都有较大的限制：对于方法1：国家对使用放射性材料有严格的限制，而且使用放射性探针需要复杂的实验设备和防护措施，只有少数单位具有操作放射性材料的资质，导致该方法无法大规模推广使用，而委托具有资质的单位进行检测则价格昂贵；对于方法2：化学修饰的方法增加DIG标记价格昂贵，靶标siRNA池中具有大量靶标siRNA，使用少量反义单链RNA作为探针容易产生脱靶标效应，若合成大量反义单链RNA，则由于化学修饰增加DIG的方法价格昂贵而很难实施。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法，利用DIG标记RNA探针来检测转基因植物中标靶siRNA池，该方法具有高度特异性，且操作简单，成本低，大幅度减少标靶siRNA池的检测成本。

本发明是基于如下理论和技术实现的：目的基因的dsRNA在转基因植物中被随机剪切为21-25nt的靶标siRNA，这些不同核苷酸序列的靶标siRNA形成靶标siRNA池。本发明通过目标基因扩增出的反义RNA链与靶标siRNA池中的各个靶标siRNA正义链均互补，该反义RNA链在Northern杂交过程中可以和各个靶标siRNA结合，具体如图1所示，提高了检测特异性和灵敏度。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法，其包括如下步骤：

(1)以目标基因DNA为模板制备DIG-UTP标记的反义RNA链：

①反应体系包括：UTP、ATP、GTP、CTP，DIG-UTP、RNA聚合酶缓冲液、目标DNA、RNA聚合酶、去离子水，10～50℃反应0～24小时。

②然后，反应体系中加入DNA酶，10～50℃反应去除反应体系中的目标DNA。

③再，加入去离子水和氯化锂溶液，-20～0℃中沉淀RNA。

④离心，弃上清，加去离子水溶解RNA沉淀，获得含有多个DIG-UTP标记的高纯度目标反义RNA链。

(2)以DIG-UTP标记的反义RNA链为探针检测转基因植物中靶标siRNA池：

①将目标基因RNA进行聚丙烯酰胺胶电泳，然后，将目标基因RNA从聚丙烯酰胺胶中转到硝酸纤维素滤膜上，烤干滤膜。

②然后，将烤干后的滤膜预杂交后，加入步骤1)获得的DIG-UTP标记的高纯度目标反义RNA链，杂交过夜。

③再，将滤膜清洗，显色、曝光、成像。

优选的，一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法，其包括如下步骤：

(1)以目标基因DNA为模板制备DIG-UTP标记的反义RNA链：

①反应体系：50～200mM UTP，50～200mM ATP，50～200mM GTP，50～200mM CTP，5～20mM DIG-UTP，10×RNA聚合酶缓冲液，1～20μl目标DNA，1～10μl RNA聚合酶，0～20μl去离子水，25～45℃，反应0～10小时。

②然后，反应体系中加入DNA酶，25～40℃反应0～1小时，去除反应体系中的目标DNA。

③再加入去离子水和氯化锂溶液，-20～0℃中沉淀RNA。

④在0～25℃下，高速离心5分钟以上，弃上清，加入去离子水溶解RNA沉淀，获得含有多个DIG-UTP标记的高纯度目标反义RNA链。