[发明专利]基于DNA标签-PCR快速检测TGEV早期感染的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)早期感染的方法，具体涉及一种基于磁性微粒富集DNA标签放大技术快速检测TGEV早期感染的方法，属于兽医学检测技术领域。

背景技术

随着规模化养猪业的发展，猪胃肠道传染病呈现递增趋势，成为危害规模化养猪生产的主要疫病，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失，同时也对这些传染病的快速诊断及防治带来新的挑战。

目前猪传染性胃肠炎(TGE)是一种常见的危害规模化养猪生产的猪胃肠道传染病，以两周龄内仔猪水样腹泻、脱水、呕吐为特征。急性感染具有感染性强、发病急、死亡率高、死亡快等特点。慢性感染则主要以多个病原体的混合感染为特点，不仅造成患病猪生长缓慢，使猪场的生产低下，而且大大提升这些疾病的诊断难度，使患病猪无法得到及时有效的治疗，病原体的传播不能得到及时有效地截断，导致感染在同一猪场的进行性扩散，最终导致大量猪的患病或死亡，使养猪业不能健康有序的发展。

目前针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的传统检测方法包括：病毒的分离与鉴定、原位核酸杂交、免疫组化、间接免疫荧光等。但这些方法具有操作繁琐、耗时费力、特异性差等缺点。虽然针对TGEV的PCR检测方法已经建立，但在感染早期，病原体的滴度尚未达到PCR检测的病毒浓度，更重要的是TGEV为单股正链RNA病毒，与DNA相比RNA不稳定很容易降解，且需要反转录为cDNA后再进行PCR检测，过程繁琐，不仅耗时，且检测费用较高。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简便、成本低、易于产业化和大规模应用的快速检测TGEV早期感染的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种基于DNA标签-PCR快速检测TGEV早期感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1、制备TGEV特异性探针标记的磁性微粒MMP，所述TGEV特异性探针序列为：

5’NH2-T15CAAATATTTCGTTTAGTTCGAGTTGGTGTCCG；

Step2、制备TGEV特异性信号探针标记的纳米金颗粒AuNPs，所述特异性信号探针序列为：

5’SH-T15CGAATAGGAAGACTAGGCACGTTGACTTACTTGTACAGCTCG；

Step3、TGEV探针标记的MMP和AuNP与TGEV病毒RNA的杂交反应及目标DNA标签的洗脱：

3a、取500μl TGEV血清样本和100μl裂解液至1.5ml离心管中，煮沸15min使病毒RNA释放，4℃、12000rpm离心5min，取上清，所述裂解液：10mmol/L Tris-HC1，1mmol/L EDTA，15mmol/L NaCl，0.5％SDS，pH 8.0；

3b、在上述裂解上清中加入100μl、pH4.8的NaAc，再加入等体积异丙醇混匀，沉淀30min，12000rpm离心5min，去上清，加500μl75％乙醇洗涤2次，10μl TE缓冲液重悬病毒核酸，前述TE缓冲液：1M Tris buffer pH 8.0，1mM EDTA；

3c、取2μl标记后的磁性微粒MMP和10μl病毒核酸，加入17μl杂交缓冲液混匀，40℃杂交30min，杂交完毕后加入2μl标记后的纳米金颗粒AuNPs，混匀后50℃杂交40min，获得AuNP-MMP复合物，前述杂交缓冲液：5×SSC，0.1％Tween-20，0.2％SDS；

3d、每次取1ml TE缓冲液，洗2-3次，去除残留的杂交缓冲液、未结合的探针和DNA标签；

3e、用100μl新配置的DTT洗脱液与AuNP-MMP复合物在室温下作用10min，磁分离3min后取上清液，前述DTT洗脱液：0.5mol/LDTT，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5；

3f、加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，沉淀30min；

3g、4℃、12000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤两次；

3h、4℃、12000rpm离心10min，弃上清，自然风干，加入3μl的H₂O溶解DNA标签；

Step4、PCR检测与TGEV特异结合的DNA标签：

4a、以pEGFP-N1为模板，

上游引物F：ATAGCGGTTTGACTCACGGG，

下游引物R：CCCTTTGACGTTGGAGTCCA，