[发明专利]一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及引物、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，特别涉及阪崎克罗诺杆菌核苷酸的引物和探针以及检测阪崎克罗诺杆菌的方法。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)原名阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)是一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。其流行病学调查显示，其感染病例大多数为婴幼儿，主要引起菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结膜炎等，并伴随有严重的神经系统后遗症。作为一种条件致病菌，其对特殊人群具有高达40％～80％的致死率。克罗诺杆菌广泛分布在婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶叶、草药、调味品及豆腐等多种食品及食品原料中。随着一系列与该菌相关的婴幼儿奶粉召回和重大感染事件的爆发，婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的污染问题受到全世界的关注。

目前包括阪崎克罗诺杆菌在内的苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)，丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)，尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universails)，穆汀斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)，都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis)6个种的克罗诺杆菌证实对人体具有致病性，而康帝蒙克罗诺杆菌(C.condiment)，以及2014年最新归类的三种C.zurichensis，C.helveticus和C.pulveris等4种还未见能引起人体疾病的报道。克罗诺杆菌属的各个种菌株对化学物质的敏感性以及温度和抗生素方面存在较大的差异，而且各个菌的致病因子在特定情况下的表达也各不相同，从而导致的致病力也不尽相同。研究表明，阪崎克罗诺杆菌与丙二酸盐克罗诺杆菌是引起人类致病的主要菌株，具有更高的致病性。阪崎克罗诺杆菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，是污染克罗诺杆菌的奶粉中分离出的主要菌株。因此在物种水平上对阪崎克罗诺杆菌进行快速和可靠的识别及检测在食品污染检测和溯源以及临床和流行病学上具有十分重要的作用。目前对克罗诺杆菌的快速检测主要存在以下三个方面问题：

1)现有检测方法落后于克罗诺杆菌属在分类学上的发展。

由于克罗诺杆菌属在分类上的不断发展，许多现有的检测方法，无法在菌种水平上对克罗诺杆菌属进行区分，例如将实际为穆汀斯克罗诺杆菌ATCC 51329当做阪崎克罗诺杆菌进行鉴定。这给食品污染检测和溯源以及临床和流行病学上的快速定型提出了难题。

2)现有的分子学方法无法适应DNA同源性极高各个种的克罗诺杆菌的特异检测。

现有的阪崎克罗诺杆菌检测方法的主要难点在于阪崎克罗诺杆菌同其他克罗诺杆菌以及肠杆菌科的其他细菌特别是阴沟肠杆菌在形态特征，生理生化特征方面具有高度相似性，并有极高的DNA同源性。因此无论是FDA推荐对该菌的检测方法还是目前的各类基于核苷酸片段的检出方法均存在选择性差的缺点，易出现假阳性或假阴性结果。目前已被用于克罗诺杆菌属检测的基因有gluA、gyrB、dnaG、ompA、ropB以及zpx等。二鸟苷酸环化酶广泛存在于各种食源性致病菌中，相关的某些基因片段在许多细菌中都具有高度的保守性，如霍乱弧菌，沙门氏菌和大肠杆菌。而克罗诺杆菌属中参与编码二鸟苷酸环化酶的cgcA基因不仅具有属内的保守性，且具有种间的等位基因的特异性差异，另外还能与肠杆菌科其他细菌进行很好的区分。2012年cgcA基因首次被用于克罗诺杆菌属的快速分型研究中，但基于cgcA基因的克罗诺杆菌的核酸检测方法未见报道。

3)现有的检测方法无法适应快速、特异和高通量的要求。

现有的检测方法主要有基于生理生化实验的传统生化检测法和试剂盒法，基于分子生物学的PCR法、基因芯片、HRM等方法。分子生物学方法比传统的生理生化方法具有快速、高通量和快速的优点。其中基于荧光探针标记的荧光定量PCR方法，比普通PCR方法具有更高的检出限和低污染，比HRM法具有更高的特异性，比基因芯片技术具有更低廉的成本和可操作性。

本发明在分析已报道阪崎克罗诺杆菌及其他克罗诺杆菌基因组序列的基础上，基于cgcA基因分别设计引物及荧光探针实现阪崎克罗诺杆菌的特异性、快速检测。采用的荧光PCR技术是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。

发明内容