[发明专利]成年大鼠海马神经元体外分离培养方法

权利要求书

1.一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法，包括以下步骤：

(1)包被培养板

配制浓度为100ug/ml多聚-D-赖氨酸溶液包被细胞培养板过夜，1ml/孔；吸去多余的多聚赖氨酸，加入无菌水漂洗一次；吸弃95％无菌水，然后将培养板置于超净工作台内自然风干备用；

(2)分离大鼠脑

将40mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射，深度麻醉、断头，然后用70％乙醇对大鼠头部进行表面消毒；迅速用冰上预冷的剪刀将大鼠头部皮毛剪开，暴露颅骨；换一把干净的冰上预冷的剪刀从头颈部开始沿颅骨中缝一直剪到嗅球前端，将颅骨及脑膜剪开，然后小心将左右两半颅骨向左向右掀起掰断，暴露出脑；使用头部扁平的解剖铲小心地沿颅腔底将大鼠脑迅速掀起取出，置于冰上预冷的盛有培养基I的35mm培养皿内；整个分离脑的过程不超过3分钟；

(3)分离海马

取一个干净的冰上预冷的60mm培养皿，内置一张浸润有培养基I的无菌滤纸，将步骤2分离出的大鼠脑转移到滤纸上；根据Bregma点确定好海马的具体位置，用尖端很细的镊子小心地将覆盖在海马上方的大脑皮层挑破掀起，暴露海马；小心将海马剥离出来，放置于新的冰上预冷的盛有2ml培养基I的35mm培养皿内；整个分离过程不超过1分钟；

(4)制备细胞悬液

取一个50ml离心管，配制蛋白酶，备用；取海马组织薄片，备用；将海马组织薄片迅速转移至盛有蛋白酶溶液的50ml离心管内，摇匀，然后置于37℃CO₂培养箱内孵育30min，每隔三分钟摇动一次；孵育完毕后，将离心管取出，加入2ml培养基I终止消化；进行吹打，重复两次并将上清一并转移至15ml离心管内；所述蛋白酶为DNA酶和2mg/ml的木瓜蛋白酶的混合物；

(5)神经元进一步纯化

配置分离液，取6ml步骤4的细胞悬液，小心地转移到分离液最上方，在22℃，800g条件下离心15min；离心完毕后，出现分层，共五层，用移液枪将第四层收集起来转移至一个冰上预冷的15ml离心管内；往上述15ml离心管内加入培养基I，22℃，200g离心2min；弃上清液，用手指轻弹管底沉淀，然后用8ml培养基П重悬，摇匀；并进行细胞活力检测；培养基П为0.5mM L-Gln，10ng/ml FGF2和双抗的NeurobasalA/B27的混合物；所述分离液为OptiPrep^TM密度梯度分离液；

(6)细胞接种

按照4.61×10⁴cells/圆玻片的接种密度接种于步骤1培养板内预先包被好的12mm盖玻片上，然后置于37℃，5％CO₂培养箱内孵育4小时后首次更换培养基；

(7)体外原代培养

搭建流动式体外培养体系，整个体系必须在37℃，5％CO2培养箱内运行；之后每隔10天换液一次；搭建所述流动式体外培养体系为：将灌注培养板的进口管以及出口管分别装上无菌微型三通活塞，然后在培养板每个孔内铺上细胞培养专用的无菌圆形盖玻片，4片/孔；根据所用塑料软管的外径，在空培养基包装瓶的盖子上打三个孔：出液孔、进液孔、气体交换孔；分别将出液管、进液管穿过出液孔和进液孔，并将塑料软管穿过培养基瓶盖子上的气体交换孔，并在塑料软管末端连接一个针头式过滤器Millipore以满足瓶内培养基与外界之间的气体交换；出液管和进液管分别通过蠕动泵与灌注培养板连接；

上述培养基I为-A/B27培养基。

2.根据权利要求1所述的成年大鼠海马神经元体外分离培养方法，其特征在于，所述双抗为100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。