[发明专利]一种羰基还原酶及其在制备(R)-奎宁醇中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种羰基还原酶，含有编码该酶的核苷酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羰基还原酶作为催化剂在不对称合成(R)-奎宁醇中的应用。

背景技术

膀胱过度活动症(OAB)是一种以尿急症状为特征的症候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁，其明显影响患者的日常生活和社会活动，已成为困扰人们的一大疾病。近年来随着我国进入老龄化社会，以及糖尿病与神经系统损害性疾病的增长，由此继发的相关疾病——膀胱过度活动症的发生率也逐年上升。

《膀胱过度活动症诊断治疗指南》中指出：OAB是一种以尿急症状为特征的综合征，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁；尿动力学上可表现为逼尿肌过度活动，也可为其他形式的尿道——膀胱功能障碍。不包括由急性尿路感染或其他形式的膀胱尿道局部病变所致的症状。

对于OAB的药物治疗，主要有以下几种：

(1)M受体拮抗剂药物治疗容易被大多数OAB患者接受，因而是OAB最重要和最基本的治疗手段。逼尿肌的收缩通过激动胆碱能(M受体)介导，M受体拮抗剂可通过拮抗M受体，抑制逼尿肌的收缩，改善膀胱感觉功能，抑制逼尿肌不稳定收缩可能，因此被广泛应用于治疗OAB。一线药物有托特罗定、曲司氯胺、索利那新等，其他药物有奥昔布宁、丙哌唯林、普鲁苯辛等。

(2)镇静、抗焦虑药。中枢神经系统的多个区域参与了排尿控制，如皮质和间脑以及中脑、延髓和脊髓。可选择与这些神经通路有关的神经递质如γ-氨基丁酸、5-羟色胺、多巴胺和谷氨酸等。OAB的治疗药物中，最常用的是丙米嗪，不仅有抗胆碱及拟交感作用，还可能有中枢性抑制排尿反射的作用，被推荐用于治疗混合性急迫、压力性尿失禁。但丙米嗪起效较慢，服用数周后才能见效。不良反应有体位性低血压及心律失常。另一抗抑郁药物度洛西汀，通过抑制中枢对 5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取，增加尿道外括约肌张力。

(3)钙通道阻断剂实验证明，钙拮抗剂如维拉帕米、硝苯地平等可通过阻滞细胞外钙离子内流从而抑制膀胱逼尿肌的收缩；钾离子通道开放剂则通过增加钾离子外流，引起细胞膜超极化，使平滑肌松弛。

(4)其他药物前列腺素合成抑制剂(吲哚美辛)、黄酮哌酯等。

其中，索非那新(solifenacin)是新一代M3受体拮抗剂，迄今已在全球50多个国家和地区上市销售，已成为欧洲、美国和日本市场膀胱过度活动症(OAB)治疗的领导品牌，受到多个权威机构和指南的推荐。现有技术中对于索非那新的合成主要包括化学法和生物法两种：

化学法主要包括拆分的方法，比如，美国专利US5744606A中公开了3-喹宁酮与路易斯酸成盐，然后在铑、铱或钌与手性二膦配体作为光学活性的复合物催化下生成(R)-喹宁醇，如下所示：

又如，美国专利US5215918A(Bend Research,Inc.)公开了一种制备(R)-奎宁醇的方法，该方法包括(R,S)-3-喹宁醇与低脂肪酸酐反应生成相应的(R,S)-低脂肪酸酯，然后(S)-构型的酯在枯草杆菌蛋白酶催化下优先水解成(S)-3-喹宁醇，分离后溶液中的(R)-构型酯水解后得到(R)-喹宁醇，反应式如下所示：

又如，美国专利US7309699中公开了(+/-)-1-氮杂双环[2.2.2]壬-3-基苯甲酸利用(L)-酒石酸拆分，然后拆分产物利用氢氧化钠水解生成(R)-奎宁醇。

再如，中国专利申请CN101585835中公开了利用(L)-酒石酸对3-奎宁醇进行拆分得到(R)-奎宁醇的方法。

上述的化学方法村存在着收率较低，或者需要使用昂贵的金属催化剂的缺陷，后来为了解决这些问题，开始进行利用生物法进行催化来合成(R)-奎宁醇。主要包括以下方法：

比如，2003年M.Ikunaka报道了一种利用蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶来拆分3-奎宁醇衍生物的方法，转化率为42％，ee值达到96％，但是这种外消旋物质酶动力学拆分的理论最大转化率为50％，并有衍生反应。

后来，中国专利CN101864370公开了3-奎宁酮利用深红酵母(Rhodotorula  rubra)X15的酵母菌株进行生物催化制备(R)-奎宁醇的方法。

接着，中国专利CN102952761公开了3-奎宁酮盐酸盐在诺卡氏菌WY1202催化下制备(R)-奎宁醇的方法。