[发明专利]用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用

权利要求书

1.用于制备固体PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：包括：

a)提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3′阻断性引物、脱氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖；

b)将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得固体集成组合物,使其易于存储和操作。

2.根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于:所述液体集成组合物的水溶液包括:反应缓冲液包含有Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、和Mg⁺⁺；脱氧核苷三磷酸和焦磷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na₄O₇P₂或其类似物；荧光染料包括SybrGreen I或连接于引物上的FAM；聚合酶包括含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶；所述非还原性双糖包括有海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖。

3.根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述液体集成组合物中还含有：

牛血清白蛋白；和/或

多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或

洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40。

4.根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述通过冷冻干燥技术获得PAP固体集成组合物的方法还进一步包括步骤：c)冷冻干燥后,加入液体性核酸模板水溶液使得冷冻干燥获得的固体集成组合物溶解。

5.根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：具体步骤如下：

(1)准备水溶液，使每5-10微升的水溶液中含有176-352mM(pH值8.0、25℃)Tris-HCl、20-40mM(NH₄)₂SO₄、2.4-10mM MgCl₂、50或90或100或180μM每一种dNTP、0.2-0.4μM每种引物、180-360μM Na4PPi，0.2-0.4×SybrGreen I染料，0.02-0.04％Tween-20，2单位聚合酶，200-400mM海藻糖，0-0.4％聚蔗糖-400，50-100g/ml BSA，和0.5-1mM DTT；

(2)冷冻干燥过程，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，具体条件为：在-50℃至-55℃快速冷冻2-4小时后，将样品抽至0-15帕压力真空并保持在-40℃至-45℃、15-30小时，然后逐渐升高温度至室温。

6.一种固体集成组合物，其特征在于：是由权利要求1-5之一所述冷冻干燥技术制备而得的。

7.根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：具有组分如下：

反应缓冲液成分，包括Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、和Mg⁺⁺；

脱氧核苷三磷酸和焦磷酸，为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na₄O₇P₂或其类似物；

荧光染料，包括SybrGreen I或连接于引物上的FAM；

聚合酶，包括含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶；

双糖，包括海藻糖，蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖，或乳果糖。

8.根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：还含有：

牛血清白蛋白；和/或

多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或

洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40。