[发明专利]副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA

说明书

技术领域

本发明涉及副干酪乳杆菌基因的siRNA分子。

背景技术

近年来研究中研究人员发现在某些G⁺菌QS体系中的AIP不仅仅是信号分子，它还具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳杆菌的植物乳杆菌素等等。这些抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)的基因簇中除了含有ABC转运体编码基因外，还有一个辅助蛋白(accessory protein，AP)编码基因，它们的产物组成了AMP输出和处理体系。AMP的结构基因都位于其相应的免疫蛋白基因之前，产生的AMP大多数富含半胱氨酸，具有疏水性，而且，经研究发现，AMP的最大生产量与产生菌的非最佳生长条件有关。

根据AMP的性质不同，可将AMP分为两大类：一类是I型AMPs或硫醚抗生素，它们是一些对热稳定的肽类，在被分泌之前会被进行高度的翻译后修饰，如nisin、枯草菌素；另一类是II型AMPs或热稳定的AMPs，它们具有特征性的双甘氨酸基序，分泌之前不存在修饰过程，但在分泌后，前体肽的N端会有一个片段被移去，如植物乳杆菌素、乳酸杆菌素P等。

副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7，革兰氏阳性菌，2003年从齐齐哈尔丰源食品有限公司乳酸酸菜发酵液中分离获得。它最大的特点是在其发酵液中可产生抑制多种G⁺、G^-和酿酒酵母生长的肽类物质，分子量在10kD左右，热稳定，酸性条件下(pH 2～6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更为优越，因为nisin能有效的抑制革兰氏阳性菌如一些腐败菌、致病菌和芽孢菌，而对革兰氏阴性菌起的作用并不大，甚至不起作用。同时经过研究还发现，当将高密度菌体发酵液(>10¹¹个/mL)添加到低密度菌体发酵液(<10⁵个/mL)中时，可促进低密度菌体中这种AMP的生成；发酵24h和48h的菌体发酵液，其抑菌能力相差较大。以上种种现象说明，该菌产生的这种AMP的产量可能受到菌群密度影响和控制。

国外Nakayama等通过PCR方法克隆到了副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因(prcA、prcK和prcR)，但对于这些基因在群体感应中的具体功能，以及AMP产量是否与群体感应有关尚不明确。

目前，基因功能的研究方法主要有两种：一种是增强基因表达，然后对获得的表达产物进行研究；另一种是减弱或者终止基因表达，通过观察生物整体功能的变化，进而推测相应的基因功能。由于第一种方法往往不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃。第二种方法中RNA干扰技术(RNAi)实际上只是在转录后水平上降低基因的表达；其中，基因敲除技术是构建基因沉默突变株最为常用的方法。但是，构建自杀质粒必须选择出合适的载体，载体质粒在受体菌中不能复制，载体质粒必须带有一个在整合到染色体内以后可供选择的抗性标记，载体质粒带有易于克隆的多克隆位点；必须选择出足够长的同源臂，同源臂越长越有利于同源重组的发生，可降低错误置换的发生率，而且同源臂又必须满足酶切位点的单一性，在同源臂内部不能包含插入时用到的限制性酶切位点；必须选择出合适的目标基因，目标基因片段与替换的片段长度相同，且不含插入时用到的限制性酶切位点，不能引入突变。所以，要同时满足上述所有条件构建自杀质粒的难度非常大；而且，同源臂的长短依赖目的基因的长短，不利于同源重组的发生。

发明内容

本发明为了解决构建自杀质粒难度大，同源臂的长短依赖目的基因的长短，不利于同源重组的发生等问题，而提供的副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA。

本发明第一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HD1.7prcR基因siRNA的核苷酸序列为5'-AUACCCAACAUUGUUUCGCTT-3'；第一种副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA的正义链核苷酸序列为5'-GCGAAACAAUGUUGGGUAUTT-3'。

本发明第二种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HD1.7prcR基因siRNA的核苷酸序列为5'-AUGCAGAACGCGAAAUCGCTT-3'；第二种副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA的正义链核苷酸序列为5'-GCGAUUUCGCGUUCUGCAUTT-3'。