[发明专利]miR-21反义核苷酸修饰的骨髓间充质干细胞的用途

说明书

技术领域

本发明涉及成体干细胞领域，通过特异性反义核苷酸序列沉默间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSCs)中内源性miR-21的表达水平增强了MSCs的免疫调节能力，并研究修饰后的MSCs用途。

背景技术

传统概念中骨髓间充质干细胞等MSCs首次分离后被证明在不同的诱导环境下可以分化为骨、软骨、脂肪、胰岛、肝脏和神经等不同组织细胞，是目前治疗骨骼疾病最常用的种子细胞，但随着体外培养时间的延长，其移植回体内后成骨能力明显下降，而且其多向分化能力也逐渐丢失。此外研究表明骨髓间充质干细胞能够通过抑制多种免疫细胞如树突状细胞，T淋巴细胞，B淋巴细胞的功能，发挥重要的免疫调节作用。临床上MSCs被运用到全身，治疗各种系统性疾病，如糖尿病，类风湿性关节炎，干燥综合征等，在机体免疫调控中发挥着重要作用。但是尚需要开发输注细胞的新途径，目前通过静脉输注细胞的方法。其所面临的问题就是植入效率不均一，对有些病例不能产生明显和持久的治疗作用。此外，随着体外培养的时间延长，MSCs也会丧失部分的生物学活性，降低应用效率。越来越多的课题组都开始意识到重新寻找构建一种提高MSCs的植入效率的重要性，使其产生更加明显和持久的治疗作用。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类参与基因转录后水平调控的小分子、非编码的单链RNA，长度19～25nt，与细胞的生长转归有密切关系，能调控细胞增殖、分化等。miRNAs介导特异性的基因沉默或激活靶mRNA而影响蛋白质合成，调控转录后水平的基因表达，现已证明miRNAs能够调控多种生理学和病理学过程[8-10]。miRNAs具有高度的生物进化保守性、组织特异性、基因簇集现象、时空特异性等生物学特性[11]。miRNAs通过RNA干扰途径降解靶mRNA；动物中miRNAs与靶mRNA的3′-不翻译区部分序列反向互补结合，与RNA干扰不同的是，靶mRNA的稳定性不受影响，而翻译起始后受抑制。因此，通过miRNAs的特异性互补反义链可以改变细胞中miRNA的表达水平，增加靶基因的转录后水平从而改变细胞的增殖，分化能力。

目前可通过在细胞中使用脂质体转染的方式特异沉默细胞内内源性miRNA的表达水平。此种改变miRNA表达的基因修饰方式与传统的基因修饰相比有：不需要病毒载体，解决了病毒在体内的不可控性的问题；转染效率高；易操作等特点。通过在细胞中使用脂质体转染miRNA的特异反义链可高效地沉默细胞内miRNA的内源性表达。在本课题组的研究中发现，miR-21的表达水平负向调控MSCs中转换生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)的表达水平。TGF-β1作为一种免疫抑制剂可以抑制免疫活性细胞的增殖和抑制淋巴细胞增殖，从而影响MSCs的免疫调节能力。因此本发明内容为利用miR-21反义链转染MSCs增强细胞分泌TGF-β1的能力，进而持续增强MSCs的免疫调节能力。之后再将miRNA反义链修饰过的MSCs应用到干细胞治疗效果不明显或者无效的系统性疾病中，提高干细胞在有效时间内对于系统性疾病的治疗效果。

发明内容

发明目的

1)提出一种简便、成本低廉、不需要病毒载体且对人体无毒副作用的干细胞修饰方法；

2)提出经上述修饰后的干细胞的制备方法；

3)提出经上述修饰增强干细胞免疫调节能力特性的优化方法；

4)提出经修饰后的干细胞可能治疗的临床疾病。

发明思路

anti-sense-miRNA作为相应miRNA的完全互补链，均是经2′-0-甲基稳定性化学修饰的小RNA分子。可以通过与对应miRNA特异性相互作用，促进该miRNA的降解，从而实现对特定miRNA功能的抑制，阻断miRNA在细胞中的作用。通过前期研究发现miR-21能够负向调节MSCs的免疫调节能力。因此本专利内容欲通过脂质体转染的方式将miR-21的反义链miR-21inhibitor转染进入细胞，特异性沉默细胞中miR-21的表达水平，阻断细胞内miR-21下游通路来提高MSCs的免疫调节能力。因此如何将这种核苷酸序列导入细胞的方式将是一个重要的考虑内容。另外导入miR-21inhibitor的浓度也是需要谨慎选择的，最佳的浓度下才可以起到最佳的效果，最后找到修饰后干细胞的制备方法及应用的适应症都是本发明专利的内容。

本发明的有益效果

1.本发明所制备的干细胞方法简便、快捷、产品无害。