[发明专利]一种细菌芽胞功能微球的制备方法与应用

权利要求书

1.一种利用细菌芽胞制备功能微球的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将所述的培养基在121℃灭菌30min，用LB液体培养基活化细菌芽胞杆菌4～6h，当OD₆₀₀＝0.6时，向每个培养皿加入200uL活化好的菌液并涂布均匀，然后在37℃培养箱中培养，收集培养3～10d的芽胞，用去离子水洗涤并离心，重复2～5次；

(2)用去离子水将芽胞重悬，将10⁸～10¹¹个/mL的芽胞分装在离心管中，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220～450W，振幅为0％～70％，超声处理10～30min，所述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min，停3min；

(3)将上步处理的芽胞用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽胞在以pH 3的盐酸溶液或pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液配制的含有0.5～2.0％的胰蛋白酶溶液中处理，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3～5次；

(4)配制与芽胞悬液等体积的去芽胞衣处理液并将芽胞重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5～4h，将处理后的芽胞用适量的去离子水重悬，得到芽胞微球；

(5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为10⁸～10¹⁰个/mL的芽胞悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育0.5～2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在芽胞表面，形成芽胞@金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的金属纳米颗粒；

其中

磷酸盐缓冲液为：磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.58g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g

去芽胞衣处理液为：0.1M NaOH,0.1M NaCl,1％十二烷基硫酸钠，0.1M二硫代苏糖醇。

2.如权利要求1所述的一种利用细菌芽胞制备功能微球的方法，其特征在于：所述的细菌芽胞杆菌是巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

3.如权利要求1所述的一种利用细菌芽胞制备功能微球的方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒选自胶体金、胶体银、胶体铂、胶体钯或立方钯。

4.如权利要求3所述的一种利用细菌芽胞制备功能微球的方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒的粒径分别如下所述：胶体金粒径为15nm，胶体银粒径为10～15nm，胶体铂粒径为5nm，胶体钯粒径为5nm，立方钯粒径为20～30nm。

5.一种细菌芽胞功能微球在制备检测动物疫病载体中的应用，其特征在于，所述的细菌芽胞功能微球采用如权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。