[发明专利]一种人类羊膜上皮细胞的分离方法

权利要求书

1.一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：

第一步，采集运输胎盘，先将采集到的新鲜胎盘放入盛有0.9%质量浓度生理盐水的无菌塑料袋中，密封后放入保护盒中；再将保护盒放入温度为2℃～8℃的运输箱中，并在12小时内运输到细胞分离室；此过程保证了胎盘组织的新鲜及羊膜上皮细胞的活性，为接下来的分离培养分离提供质量保证；

第二步，撕取羊膜，细胞分离人员将接收到的新鲜胎盘放置在圆盘中，先用生理盐水冲洗新鲜胎盘表面，再从新鲜胎盘上完整的撕下羊膜；

第三步，冲洗羊膜，先将撕下的羊膜放入肾形盘中展开冲洗，并用止血钳去除羊膜上的血丝，再用生理盐水反复冲洗至少5次，直至羊膜干净；

第四步，剪裁羊膜，先将冲洗干净的羊膜剪裁成圆形，圆形直径大小较相应培养皿直径大3～4cm，将圆形的羊膜上皮面朝上覆盖于培养皿上，并且圆形的羊膜边缘必须在培养皿边缘之上；这样操作为了确保在接下来的消化过程中胰蛋白酶只单独接触羊膜上皮面；

第五步，消化羊膜上皮面，将0.25%质量浓度的胰蛋白酶液加入到覆盖有羊膜的培养皿中，直至胰蛋白酶液接近装满培养皿，在使羊膜上皮面充分接触胰蛋白酶同时，羊膜的其他部位接触不到胰蛋白酶；在37℃恒温静止消化40～80分钟；消化时间的长短因不同个体羊膜的厚度、面积等不同而有所变化；

第六步，终止消化，消化结束后，先用移液管将培养皿中的胰蛋白酶液吸出并弃之，再用移液枪加入含10%体积浓度胎牛血清的EMDM-F12培养液，并用移液枪吹打培养皿中的羊膜上皮面，使上面的经过消化的羊膜上皮细胞脱离羊膜进入到细胞培养液中，经过反复吹打直至细胞培养液变的浑浊，然后，收集细胞培养液置于50ml离心管中；此步骤重复3～5次，以便分离下更多的羊膜上皮细胞；

第七步，离心收集细胞，将收集到的细胞培养液在离心机上，以300～500g离心力离心5～10分钟；

第八步，羊膜上皮细胞重悬并接种培养，离心后弃去上清液，离心管底部的羊膜上皮细胞沉淀用10mlEMDM-F12培养液重悬，取少量悬液用于细胞计数、活率检测以及流式检测，以1.0～1.3×10⁵/cm²的密度接种细胞。