[发明专利]一种两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法

权利要求书

1.一种两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于，该方法的步骤包括：1）DNA提取；2）PCR扩增；3）测序；4）关联分析；所述步骤3）的具体方法包括以下步骤：

3-1）制备单链DNA模板：将PCR扩增产物均匀分成2～3份，分别与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0.05-0.2 M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板；

3-2）测序引物杂交：将测序引物与上述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80℃下放置5-10 min，自然冷却至室温，完成杂交得到杂交产物；

3-3）测序：配备测序反应体系，与所述步骤3-2）得到的杂交产物混合，选择三组（(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP),(dATPαS+dCTP) / (dGTP+dTTP),(dATPαS+dTTP)/(dCTP +dGTP)）中可能合成循环测序的2～3组进行测序，得到2～3组测序编码测序信息。

2.根据权利要求1所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：步骤3-2）中，所述测序引物是一段与步骤3-1）中单链DNA模板完全互补的一段序列。

3.根据权利要求1所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：所述步骤3）中，每个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类信息和测序信号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度均可以转化为核苷酸合成的数目。

4.根据权利要求1所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：所述步骤4）关联分析中，根据2～3组不同两核苷酸合成循环测序分别得到的2～3组编码信息，按照两次测序相同位置碱基及其数目相等的原理，将2～3组编码信息分解成最大一阶的整数编码和小于1的非整数编码，并依次进行解码，根据对于小于1的非整数解码的信息，构建关联方程式，确定PCR产物的不同DNA模板及其含量。

5.根据权利要求4所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：所述关联方程式为：对于包含任意一个SNP位点的PCR产物，可能包含不超过四种不同的DNA模板，即变化位点碱基为A/G/C/T之一，设定这四种DNA模板1、…、i的含量分别为x₁、…、x_i，且x₁+ … + x_i=1，其中0≤x_i<1、1≤i≤4；在至少两组不同两核苷酸合成循环测序信息解码的得到的最大一阶编码信息中，至少包含一个小于1的非整数测序编码信息反映SNP位点变化；包含SNP位点的单个测序反应测序信息反映该两核苷酸在本次测序反应中合成的核苷酸数目，从而构建出一个方程式；在SNP位点的存在A/G/C/T四种变化的情况下，需要两个单个测序反应方能将该位点的A/G/C/T信息全部测定，从而可以构建两个独立的方程式；从另一组循环测序中同样可以构建两个独立的方程式；另外，于同一位置碱基信息在两次测序中信息不变的原理，在两组测序信息中包含同样碱基及其与含量信息，因此上述四个方程式是有关联的，这样通过构建方程组，求出x₁、…、x_i的具体数值。

6.根据权利要求5所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：所述关联分析是指将SNP位点上的测序信息进行关联分析，是指对包含至少两组不同两核苷酸合成循环测序信息进行解码后的关联，即在解码出的小于1的非整数解码的信息中构建关联方程式，以确定PCR产物的不同DNA模板及其含量；

若PCR产物中包含若干个SNP位点的分析，则将进行若干单个SNP位点的关联分析。

7.根据权利要求1所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：所述步骤2）中，PCR扩增所用的PCR一条引物为5’端被生物素、氨基或者丙烯酰胺基团修饰，与表面修饰链霉亲合素、羧基的固相载体反应，或者与丙烯酰胺单体聚合反应制备单链DNA模板。

8.根据权利要求1所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：加入两核苷酸测序的检测分子是相同的，所述检测分子为化学发光检测的焦磷酸盐、电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。

9.根据权利要求4所述的两核苷酸合成测序分析多模板PCR产物的方法，其特征在于：所述PCR产物，其分析包括单个样本PCR产物和混合样本PCR产物的分析。