[发明专利]一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法

权利要求书

1.一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离方法是通过贴滤膜法从种蛋中取出无卵黄污染的干净鸡胚，然后在解剖镜下从鸡胚中获取生殖新月组织；

(2)用胰酶将生殖新月组织消化成单细胞，然后对单细胞中的PGCs进行纯化；

(3)将纯化后PGCs置入含有BRL-3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中培养；

步骤(1)包括以下步骤：

a)新鲜种蛋孵化到5-8HH期，无菌条件下小心打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中，分开蛋清和蛋黄，用眼科剪剪破胚盘上部的浓蛋清，将蛋清刮除干净，露出干燥的卵黄膜；

b)取一片直径25mm的微孔滤膜贴于胚盘上部的卵黄膜，按压，使滤膜和卵黄膜紧紧粘附在一起，用镊子夹住滤膜的边缘，用眼科剪小心的沿着滤膜剪开卵黄膜，剪取胚盘，提起滤膜离开卵黄；

c)将附着在滤膜上的胚胎垂直的浸入PBS中，将胚胎放于腹侧面，旋转滤纸，除掉绝大部分附着在胚盘上的蛋黄；需要准备3～5个装有PBS的培养皿，除尽蛋黄，胚盘在使用PBS洗涤的时候，整个的胚盘会从滤膜上脱落下来，和卵黄膜分开；

d)将分离的胚盘置于解剖镜下，找到生殖新月区域，用镊子剥离生殖新月组织，将周围的其他组织切除，得到的生殖新月组织收集在无菌的Ep管中；

所述BRL-3A细胞饲养层的制备包括以下步骤：

a)将冻存的BRL-3A细胞在已预热至37℃的水浴锅中迅速解冻，逐滴加入培养基稀释至4倍；

b)1 000rpm离心5min，弃上清，用含10％血清的配制的培养基重悬细胞，转移至细胞培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养；

c)选择生长状况良好、80％-90％汇合的细胞，去掉培养基，用PBS洗涤后加入含10μg/mL丝裂霉素-C的细胞培养基，37℃孵育2h；

d)去掉培养基，用PBS洗涤BRL-3A细胞4-6次，以确保完全去除丝裂霉素-C；

e)用胰酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵个/mL，接种于培养板中，置37℃，5％CO₂，培养箱中培养，24h后使用；

f)密切观察细胞生长情况，若发现细胞过稀则补加丝裂霉素-C处理过的细胞，以保证细胞铺成单层，能连成一片而没有间隙；

g)将制备好的饲养层放置在培养箱中备用，使用前去除培养液且用PBS洗5次，换为干细胞培养液；制备好的饲养层在5天内使用；

所述PGCs完全培养液的配方如下：总和100mL，

2.根据权利要求1所述一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)包括：

使用胰酶消化生殖新月组织，离心接种，向含有生殖新月的Ep管中加入37℃预热的0.25％胰蛋白酶，37℃消化5min，以含有5％的FBS的DMEM终止消化，1 000rpm离心5min，弃上清，用培养液重新悬浮细胞，然后对PGCs进行纯化。

3.根据权利要求1或2所述一种鸡生殖新月来源PGCs的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)生殖新月来源PGCs的体外培养：

(1)将重悬的生殖新月细胞接种于铺有BRL-3A细胞饲养层的6孔板上，并以PGCs完全培养液，置于37.5℃、含5％CO₂的培养箱中进行原代培养；

(2)原代培养3天后，收集培养液，其含有悬浮的PGCs，1 000rpm离心5min，弃上清，用完全培养液重新悬浮细胞，调整细胞密度，重新溶于新培养液置于新饲养层上进行传代培养；

(3)待PGCs原代培养5-7天后会形成PGCs克隆，克隆形成即可进行细胞传代。