[发明专利]鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及养殖技术领域，特别涉及一种鲫鱼鲤疱疹病毒2型的基因检测试剂及检测方法，适用于鲫鱼鲤疱疹病毒2型的流行病学监测、鲤疱疹病毒2型的检测及基因工程技术等领域。

背景技术

鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)，又称疱疹病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviralhaematopoietic necrosis virus，HVHNV)或金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)。该病毒在1992-1993年首次在日本养殖的金鱼被分离鉴定，也是该病的首次报道，曾给日本金鱼养殖业造成了巨大的经济损失，死亡率高达100％。该病毒2009年在我国江苏地区首次出现，濒死鱼的血液会顺着鳃丝流出，渔民称之为“鳃出血”，2010年在该地区广泛暴发，2011～2012年，该病毒继续蔓延，导致鲫鱼主要养殖区的异育银鲫暴发了“鳃出血”病，死亡率达80％以上。根据流行病学调查，综合电镜观察、分子检测和回归感染实验，确定“鳃出血”病原为CyHV-2。该病传播范围广、传染性强、发病快、致死率高，已给我国鲫鱼养殖业造成了巨大的经济损失，成为我国水产养殖中危害最为严重的病毒性疾病之一。为了及早发现养殖鱼类是否被CyHV-2感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。

传统病毒病的诊断需要进行病毒分离，细胞培养，电镜观察以及免疫检测等方法，缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于鲤疱疹病毒2型的检测。

本发明通过下述技术方案实现的。

1.鲫鱼鲤疱疹病毒2型的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：

KCl，

MgCl₂，

Tris-HCl，pH5.8，

dNTP；

(2)检测引物的设计合成：上游引物C-F：5’-CGCAGCGGGATCATCCCAATC-3’，下游引物C-R：5’-CGATGTGTATTTCATATAGTG-3’，浓度为10μM；

(3)Taq酶；

(4)灭菌的ddH₂O；

(5)阳性对照液：鲫鱼鲤疱疹病毒2型基因组DNA；

(6)阴性对照液：健康鲫鱼基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测鲫鱼鲤疱疹病毒2型的方法为：

(1)鲫鱼鲤疱疹病毒2型DNA的提取：取鳃、脾脏、肾脏组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH₂O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；

(2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；

(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；

(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；