[发明专利]免预培养高效菊苣遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种免预培养高效菊苣遗传转化方法。本发明采用子叶组织作为外植体，与传统外植体真叶相比，本发明采用的子叶外植体可以由消毒的种子萌发而来，而子叶由于有种皮保护，因此，可以采用酒精和84消毒液灭菌方法，同时也保护了实验操作者和环境免受升汞的危害。本发明简化了实验步骤、缩短了实验时间、极大地减少了实验成本。本发明外植体准备只要3‑5天,而且不需要经过预培养；由于子叶细胞贮存了丰富的营养物质，因此利用黑暗条件抑制子叶细胞分裂，在恢复光照条件后其利用自身营养物质迅速分裂的特点，不需要对外植体预培养可直接用于遗传转化，极大的减少了人力、物力与时间成本。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其是一种免预培养高效菊苣遗传转化方法。

背景技术

菊苣是菊科多年生草本植物，又称咖啡草或咖啡萝卜。其根、叶均可食，是一种重要制糖原料、香料、蔬菜及饲草作物；同时是一种重要的制药原料，富含倍半萜烯内酯、糖苷、类黄酮、香豆素、花青素、有机酸与细胞分裂素等，具有治疗腹泻、发热及呕吐功效。自从20世纪80年代引入我国后，在山西、陕西、浙江、河南等地推广，现主要分布在西北、华北、东北等暖温带地区。然而由于菊苣原产地在欧洲，我国拥有的野生种质资源比较匮乏，以常规育种的方法对菊苣遗传改良受到极大的限制。同时其适宜性广，在全国各地都有种植，但在各个区域可能面临不同的制约条件，所以借助现代分子生物学手段实现种质创新，是菊苣育种的一个重要环节。转基因方法能够打破物种界限，快速定向的对目标性状进行遗传改良，加快育种进程，是一种高效、经济的新技术。

菊苣的体外再生体系从上个世纪80年代就已经开始研究，1985年Profumo 等首次利用悬浮细胞系成功诱导了体细胞胚，培育了再生植株，随后的科学家利用根结、叶片、叶柄、茎等不同外植体都成功培育了再生植株。在随后的研究中，通过在培养基中添加甘油、七叶树甙、硫酸腺嘌呤盐等物质提高菊苣组织培养过程中愈伤与体外再生植株形成的概率，但转化效率仍然不高。最近的研究主要集中在对组织培养过程的激素种类和浓度进行优化，特别是强细胞分裂素噻苯隆（TDZ）和6-苄基腺嘌呤（6-BA）的应用，显著提高了组织培养过程中愈伤诱导与植株分化的成功率，组培体系的成功建立为转基因研究奠定了基础。

与其它农作物相比，菊苣转基因研究开展的相对较晚，涉及的目标基因主要包括抗性基因NPT，报告基因GUS和GFP等，功能基因的遗传转化仅限于抗冻基因LOL1、抗坏血酸过氧化物酶APX、编码Na⁺/H⁺转运蛋白的基因AtNHX1等。这些遗传转化方法大都采用3-4周的植株叶片作为外植体，在农杆菌转化之前，外植体材料需先经过一个预培养过程，经农杆菌侵染之后的外植体因受到伤害较大而死亡，愈伤与再生芽的诱导率较低，整个过程较为繁琐。错过外植体最佳取样时期、预培养时间不合适以及农杆菌侵染的毒副作用往往导致转化效率下降甚至转化失败。因此，研究更加简单、高效、稳定的菊苣转基因方法是实现对菊苣高通量遗传转化的前提与技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的是：提供一种免预培养高效菊苣遗传转化方法，它转化成功率高，能减少玻璃化苗的比例，且转化程序简单、成本低廉，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：免预培养高效菊苣遗传转化方法，将消毒好的菊苣种子播种于种子培养基中，完全遮光培养3-5天；取分生能力旺盛的子叶组织为外植体；将农杆菌采用农杆菌悬浮培养基进行活化后，直接用农杆菌侵染后，采用共培养培养基进行共培养、采用愈伤诱导培养基进行诱导愈伤、采用分化培养基进行诱导再生芽，以及采用生根培养基进行生根；利用光诱导子叶细胞快速分裂的特性，实现快速高效地对菊苣的遗传转化。