[发明专利]一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法

权利要求书

1.一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，一级种子的制备：首先将液体种子培养基在三角瓶中装液30mL-50mL，调节pH至7.0，经121℃灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种菌株，于40-45℃的摇床上培养18-24h，得到一级种子液；

步骤2，二级种子的制备：按照6-10v/v%的接种量将培养好的一级种子液接种到二级种子培养基中，32-37℃培养18-24h，得到二级种子液；

步骤3，自动发酵罐发酵工艺：将发酵培养基装入发酵罐中，12l℃下灭菌25 min，将步骤2所得二级种子液倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压0.05Mpa，发酵开始到发酵24h，发酵温度控制在40-45℃，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培养基初始pH7.0；发酵24-48h，发酵温度提高到45-50℃，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维持150r/min，发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL，发酵至60h时，向发酵液中添加营养液200mL，发酵48h-72h，发酵温度降为35-40℃，通风量降至3L/mm，发酵至72h，发酵罐放出一半体积发酵液，然后添加补料培养基和发酵促进剂，35-40℃条件下继续发酵36h后终止发酵；

步骤4，酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4℃、8000r/min、离心20min，所得上清进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt%麦芽糊精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂；

所得阿魏酸酯酶制剂酶活力为378U/g，35℃-65℃的酶活在80%以上；

所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DBM12，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.8672。

2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤1中液体种子培养基配方为：牛肉膏0.4g、蛋白胨0.8g、酵母粉1g、NaCl 0.5g、KH₂PO₄ 0.1g、MgSO₄·7H₂O 0.04、蒸馏水100mL、pH7.0，121℃灭菌20min。

3.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤2中二级种子培养基配方为：豆饼粉1g，玉米粉2g，葡萄糖2.5g，蛋白胨1g，硫酸铵0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.015g，KH₂PO₄ 0.008g，定容l00ml，pH 7.0-7.4，121℃灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤3中发酵培养基配方为：豆饼粉10g，玉米粉20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，(NH₄)₂SO₄ 5g，KH₂PO₄ 1g，微量元素10mL，泡敌0.001g，定容至1000mL，调节pH7.0-7.5，121℃灭菌15min；其中，微量元素：CaCl₂ 2g/L，MnSO₄·4H₂O 0.1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.6g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5g/L，CoCl₂·6H₂O 2g/L，NaCl 1g/L，CuSO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5/L。

5.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤3中补料培养基配方为：大豆秸秆粉10g、麸皮粉20g、玉米皮粉10g、豆腐渣20g，定容至1000mL，121℃灭菌15min。