[发明专利]一种靶向SRSF6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用

说明书

本发明公开了抑制SRSF6基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法，所述的shRNA序列为F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGC TTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'，R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTAT TCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'；所述慢病毒表达载体是将上述的shRNA插入载体质粒PLKO.1中,构建PLKO.1‐SRSF6‐shRNA；载体测序验证正确后将其和包装质粒PSPAX2和PMD2.G中转染HEK293T细胞获得慢病毒悬液；用此悬液去感染结直肠癌细胞,然后用嘌呤霉素筛选验证病毒包装是否成功；Western Blot验证其能明显降低SRSF6的表达水平；并能显著降低结直肠癌细胞的增殖能力和迁移侵袭能力；其中SRSF6对肿瘤细胞迁移侵袭能力的作用的研究尚数首次。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种shRNA的构建及应用。具体来说，本发明针对人SRSF6基因的mRNA序列设计合成shRNA，所述shRNA转入结直肠癌细胞后能抑制所述肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭。

背景技术

RNA剪接(RNA splicing)：从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。最终形成成熟的mRNA还包括5’末端的加帽(加上m7‐Gppp),以及在3’末端多聚腺昔酸化。在真核生物中,平均每个细胞基因包含约8个内含子,前体mRNA的长度通常为成熟mRNA的4‐10倍,绝大多数部分在加工过程中被切除。

在RNA剪接过程中，SR蛋白家族成员发挥了至关重要的作用。SR蛋白家族成员都具有一个富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的RS结构域,在RNA剪接体的组装和选择性剪接的调控过程中具有重要的作用。绝大多数SR蛋白是生存的必需因子,通过其RS结构域和特有的其他结构域,实现与前体mRNA的特异性序列或其他剪接因子的相互作用,协同完成剪接位点的正确选择或促进剪接体的形成。同时SR蛋白家族成员也在RNA的转运，RNA的降解等方面发挥着重要作用。

SRSF6属于SR蛋白家族一员，同样可以对RNA前体进行选择性剪接。在肿瘤领域内，SRSF6会促进皮肤癌的异常增生，是一个癌基因[Mads A Jensen，et al..Splicing factorSRSF6promotes hyperplasia of sensitized skin.nature structural&molecularbiology.VOLUME 21NUMBER 2.FEBRUARY 2014.]。在结肠癌和肺癌中，SRSF6同样可以促进肿瘤细胞的增殖[Jensen MA，etal..The splicing factor SRSF6is amplified and isan oncoprotein in lung and colon cancers.VOLUME 229NUMBER 2.MARCH 2013.]。

发生转移是恶性肿瘤最普遍的生物学特征，也是影响患者生存和预后的关键因素，结直肠癌不仅发病率高且在中晚期极易发生转移，成为治疗失败的主要原因。肿瘤转移是由肿瘤细胞的迁移和侵袭能力决定的。而目前关于SRSF6在结直肠癌转移方面的研究还是一片空白。本发明首次证实了SRSF6对结直肠迁移和侵袭方面的作用，这也是SRSF6对所有肿瘤细胞迁移侵袭方面功能的首次验证。总之，本发明构建了针对SRSF6的shRNA，所述shRNA转入结直肠癌细胞后，发现有效抑制了结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，为恶性肿瘤的治疗提供了一条途径。

发明内容

本发明针对结直肠癌肿瘤细胞致病性最重要的两个因素增殖和转移，构建了一种shRNA。这种shRNA是基于PLKO系统设计包装完成的。其正义链和反义链的序列分别为：

F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'