[发明专利]一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用。

背景技术

自DNA结构模型确定以来，核酸研究在分子生物学和医学等领域呈指数式发展，并在最近的几十年里经久不衰。核酸剪切作为核酸研究中最重要的技术之一，在基因表达、编辑、检测、测序等许多领域被广泛应用。

核酸的剪切从本质上而言就是使核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。能到达这一目的的方法有很多，大致可分为化学方法、物理方法和生物方法三类。化学方法主要是利用如铈离子、多胺铕铽络合物、α-噻吩甲酰三氟丙酮-哌啶铈等化学物质在特定溶液体系内使磷酸二酯键断裂，物理方法主要是采用超声等物理手段使磷酸二酯键断裂。这两种方法对任何核苷酸序列均可适用，但无序列特异性，因而其实际应用必然受到限制。生物方法则是在各种核酸酶的催化下来完成核酸剪切。例如，S1核酸酶可降解单链DNA或RNA，各种外切酶(Exonuclease)可以从双链DNA的3’或5’粘性末端逐一剪切核苷酸，但上述这几种酶也只能实现非特异性或半特异性的核酸剪切。而对于目标核酸序列的特异性剪切则必须依赖于限制性内切酶(Restriction endonuclease)和由其改造而成的切口内切酶(Nicking endonuclease)。这两类酶都可以特异性地绑定在其特定的识别序列上，进而对目标核酸序列实施精确的剪切，但它们的剪切方式又有所不同。限制性内切酶是对双链目标核酸序列的二条链进行剪切，以切断整个双链而形成粘性末端与平末端；切口内切酶是对双链目标核酸序列的其中一条链进行剪切，即只在一条单链上产生切口。限制性内切酶和切口内切酶均常用于质粒的重组等基因工程领域以及基因表达、测序等许多研究中，另外切口内切酶也常用于核酸等温扩增方法的建立。

然而，这两类酶均需要目标核酸序列中含有其识别序列，且剪切位点只能位于该识别序列内或附近的某一固定位置，无法按实际需要实现精细调节，针对不同的目标核酸序列来还需选择不同的内切酶才能实现剪切，因而其通用性较差，对于有些序列片段甚至会由于没有适合的内切酶而无法实现特异性剪切。因此，亟需发展一种简单、通用、精确、可调的核酸剪切方法。

发明内容

本发明提供了一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用，采用该核酸定位探针指导内切酶进行核酸剪切时，无需目标核酸序列中含有内切酶识别序列。

一种核酸定位探针，包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。

内切酶与上述核酸定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链识别区与目标核酸序列的杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序列的精确剪切。

核酸定位探针的结合区只是核酸定位探针双链中的一部分区域，结合区的两端还可以有非内切酶识别序列；同样，上述识别区也只是核酸定位探针单链的一部分区域，识别区的两端还可以有非目标核酸识别序列；但是，结合区与识别区必须相互靠近，以确保内切酶能够剪切到目标核酸序列，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数(单链区按核苷酸数计)根据内切酶的类型来确定。

本发明所述的“靠近”是指结合区与识别区不宜间隔过大，以避免内切酶无法剪切目标核酸序列，结合区与识别区相互间隔的核苷酸数应根据具体内切酶识别序列与剪切位点间的核苷酸数量来确定。

作为优选，所述核酸定位探针包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，或者所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。

更优选的是，所述核酸定位探针不仅包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，而且还包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。

进一步地，所述单链环的核苷酸数量大于等于0，小于等于50。

理论上，本发明所述的核酸定位探针只需具有结合区和识别区即可实现核酸剪切，针对上述结构区域，本发明提供了多种可行的核酸定位探针结构，具体如下：

所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分互补杂交形成。