[发明专利]无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和生产生物柴油的应用

说明书

本发明提供了一种无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和应用。本发明的制备方法包括以下步骤：1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交联助剂为血清白蛋白；2)向第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶进行沉淀，静置后得到含米根霉脂肪酶的第二溶液；3)向的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然后将该混合溶液孵育，其中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二醛；4)将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体。本发明的无载体固定化米根霉脂肪酶催化油脂转酯化反应较强，重复使用多次后仍保持较强活性。

技术领域

本发明涉及无载体固定化脂肪酶及其制备方法和应用，尤其是无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和生产生物柴油的应用。

背景技术

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)，即三酰基甘油酰基水解酶，是一类既可以催化油脂水解又可以进行转酯化反应的酶。脂肪酶广泛存在于许多动植物及微生物中，尤其在微生物中有着广泛的分布。目前已知有细菌、放线菌、酵母、丝状真菌共计65个属的微生物产脂肪酶。绝大多数脂肪酶可以用来催化油脂水解，但只有部分脂肪酶可以用来催化油脂的转酯化反应。脂肪酶水解油脂后生成游离脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯，其转酯化反应则是催化甘油三酯与短链醇之间的酯交换反应，生成甘油酯和单链脂肪酸酯(即生物柴油)的过程。由于脂肪酶催化反应高效、反应条件温和且无毒副产物，所以作为一种重要的工业用酶广泛应用于食品工业、皮革工业、洗涤工业、医药饲料工业及生物能源等方面。

与液体脂肪酶相比，载体固定化脂肪酶具有稳定性强、易于控制和分离、便于运输和贮存、可实现反复多次使用并且有利于自动化生产等明显优势。

中国专利申请CN104087571A以含氢硅油疏水改性的二氧化硅为载体固定脂肪酶，在具有较高催化活力及良好稳定性的条件下，其重复使用性得到有效提高，重复使用12次以后，酶活力仍能保持最初的80％以上。

中国专利申请专利CN103882004A以纤维素生物质碳化成生物炭基质，采用油酸分子修饰的纳米凝胶对生物炭基质表面包被，包被后的生物炭基质与脂肪酶溶液接触进而对脂肪酶进行界面活化与交联固定，冷冻干燥后获得固定化脂肪酶，该方法进行处理的脂肪酶的催化活性得到大幅度的提高。

美国专利申请US5817493利用脂肪酶与含有不可水解有机物成分之间的Si-C化学键将酶分子固定在一种硅基质上，实现了脂肪酶的稳定高效催化和重复利用。

美国专利申请US5508185使用酸性溶液溶解低分子可溶的壳聚糖形，然后使这种壳聚糖与一种多元醇的缩水甘油醚和酸卤化物反应形成一种多孔的固定化酶载体，脂肪酶分子通过共价结合与这种载体交联，获得了比游离脂肪酶高出50-60倍的催化效率。

目前研究开发出的这些载体固定化脂肪酶通常具有稳定性好、回收率高和可重复使用等优点，但是不能很好地满足机械强度高、价格低且易于制备和活化的要求。

基于此，技术人员一直在致力于研究新的脂肪酶固定化方法，以弥补上述不足。

中国专利申请CN102154256A公开了一种无载体固定化脂肪酶的制备方法，将扩展青霉脂肪酶(PEL-CLEA)在硫酸铵沉淀后利用交联剂戊二醛把酶分子交联聚集，来实现脂肪酶固定化目的。这种无载体固定化脂肪酶虽然具有成本低、易于操作的优点，但是效率和可重复使用性表现较差。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和应用，通过本发明的制备方法得到的无载体固定化米根霉脂肪酶成本低、催化效率和可重复使用性表现优异，特别适用于生物柴油的制备。

本发明提供的无载体固定化米根霉脂肪酶的制备方法包括以下步骤：

1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交联助剂为血清白蛋白；