[发明专利]一种花生AhLEC1B组成型启动子的克隆和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的来源于花生AhLEC1B基因的组成型启动子的克隆和应用。

背景技术

启动子是位于结构基因5′端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子决定着转录的方向和转录的效率，同时对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，是理解基因表达和转录调控机制的关键，是植物基因转录调控的中心。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研究中，组成型启动子的应用最早、最为广泛。在转基因育种或用于研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。

在双子叶转基因植物中使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子。单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和水稻的ActinI启动子，另外还有来自章鱼碱合成酶基因Ocs启动子和根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Nos启动子。有研究表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定表达中比外源启动子更具有优势。此外在植物基因工程中应用从病毒中克隆出来的启动子序列，可能存在潜在的生物不安全性。并且，重复使用同一种组成型启动子驱动两个或两个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象。因此，寻找双子叶植物组成型启动子，对于双子叶植物的遗传改良具有重要应用价值。

近年来，国内外多个实验室开展了花生抗逆和籽粒储藏物质积累相关基因启动子的克隆与研究，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生籽粒中多个主要储藏蛋白—过敏原Arah1、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定(Viquez等,2003；2004；Zhong等,2006；Bhattacharya等,2012)，花生Arah2启动子驱动GUS在种胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动GUS在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因AhOleo17.8、AhOleo18.5启动子(Li et al.,2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等,2013)、AhACP(单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。干旱胁迫下花生中调控脱落酸生物合成的AhNCED1基因启动子(梁建华等,2007)、抵御外来病害相关的ARAhPR10基因启动子(温世杰等,2012)也已被克隆研究。

发明内容

基于上述现有技术，本发明的发明人经过深入研究，从花生中克隆获得了一个新的组成型启动子，该启动子来源于花生AhLEC1B基因，该启动子核苷酸序列如Seq ID No:1所示，包括5′端非翻译区52bp和其上游66bp区段，具有高效驱动功能。本发明构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，自起始密码起-32～-149调控区的启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎、叶、花、种胚中均能高效表达，且驱动效率与CaMV35S近似。

该启动子是在通过染色体步移技术获得AhLEC1B基因5′端上游1289bp序列(其核苷酸序列如Seq ID No:2所示)的基础上，设计特异引物进行扩增得到的118bp AhLEC1B基因5′端上游序列，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示。经转录起始位点分析发现，花生AhLEC1B基因转录起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE和PLACE软件对该118bp AhLEC1B基因启动子进行顺式调控元件分析，该序列除包含启动子中心元件TATA BOX、增强启动子活性的CCAAT BOX，还包含叶肉表达调控元件CACTFT PPCA1(YACT)、花粉中表达调控元件GTGA Motif(GTGA)，另外，还包含植物特有的碳代谢相关的Dof蛋白结合位点DOF CORE、细胞分裂素响应调控元件ARR1AT(NGATT)及光响应调控元件GATA BOX(GATA)、GT1 CONSENSUS(GRWAAW)。存在启动子调控元件的位置如说明书附图2所示。