[发明专利]对Bt毒素具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因蛋白片段PxCAD1及应用

说明书

技术领域

本发明属农业微生物学应用技术领域，具体涉及一种具有杀虫增效作用的小菜蛾钙粘蛋白基因片段的克隆、表达及其编码的多肽片段在Bt杀虫剂中的应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)，存在于土壤中，是能够形成芽孢的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中，能够产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins，ICPs，又称δ-内毒素)，因其对害虫高效、对非目标动物安全、对环境友好而在世界范围内得到广泛应用。Bt毒素目前已成为世界范围内应用最广和产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总产量的95％以上。编码Bt杀虫蛋白的基因也被转入到多种重要的粮棉作物中，至2009年底，全世界种植的转Bt基因农作物面积已达13400万公顷，在减少害虫危害、增加作物产量、减少化学农药对环境的污染等方面发挥了重要作用。

Bt产生的杀虫晶体蛋白中，占主要的是Cry和Cyt两种毒素蛋白。这两种毒素蛋白都属于同一类孔道毒素蛋白(pore-forming toxins,PFT)。Bt毒素对昆虫的作用机理尚不完全明确，3D-Cry类毒素的作用机制被普遍接受是孔道形成和信号传导两种假说。有研究表明，几丁质酶、Cyt蛋白、营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，VIPs)、辅助蛋白(Accessary proteins)P19、P20、P21和Zwittermicin A等均可增强Bt毒素的杀虫作用。近年来，也发现钙粘蛋白片段(Cadherin)、氨肽酶氮(Aminopeptidase N)及碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)等也可增强Cry毒素的杀虫活性。钙粘蛋白属依赖于钙离子的跨膜蛋白家族中的一类，在多细胞间起连接和保持细胞完整性的作用，还在细胞增殖、分化过程中起连接蛋白作用，并能调节胞外结构域与胞质结构域的信号转导途径。它是Bt Cry毒素的初级受体，介导Bt Cry毒素毒杀害虫的过程。目前，在烟草天蛾(Manduca sexta)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、家蚕(Bombyx mori)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、小菜蛾(Plutella xylostella)、二化螟(Chilo suppressalis)、美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spdoptera frugiperda)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)等鳞翅目昆虫，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifeFa virgifera)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、赤拟谷盗(Tribolium castaneurn)等鞘翅目昆虫，及冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)等双翅目昆虫中，钙粘蛋白氨基酸序列均已被确定。昆虫的钙粘蛋白从N端至C端依次是信号肽、由9～12个重复子(cadherin repeats，CR)组成的重复区、近膜区(membrane proximal extracellular domain，MPED)、跨膜区(transmembrane domain)和胞质区(intracellular domain)5个功能区域。通过抗性Cry1Ac与钙粘蛋白结合位点之间的紧密联系进行回交分析发现钙粘蛋白是基于开发以DNA为基础的监测苏云金芽孢杆菌抗性田间种群鳞翅类害虫的首选靶标。