[发明专利]一种检测牛流行热病毒的LAMP方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测牛流行热病毒的LAMP方法。

背景技术

牛流行热俗称三日热或暂时热，是由牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病。主要侵害奶牛，黄牛次之，水牛很少发生。该病以发病急、传播快、高热、呼吸道炎症、四肢关节疼痛、行动僵拘等为主要特征。本病在我国主要见于南方，如广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、江西、江苏等省区常发，尤其是夏末初秋、高温季节较多发生。目前，在北方地区也时有本病的流行，给我国养牛业造成较大的经济损失。

一般根据牛流行病学特征，临床症状和病理变化的特点，可以对该病做出初步诊断。需要确诊的，可以借助一些实验室检测手段来进行，如中和实验、补体结合、ELISA、间接免疫荧光实验来检测血清中的特异性抗体，但大部分诊断技术程序繁琐，检测的效果也不是很理想；另外也可以在发热初期采血进行病毒分离，或者用荧光定量PCR的方法检测特异性抗原，但是，这些检测技术的灵敏性都不是很好，而且对实验条件和设备的要求比较高。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物。

本发明的另一个目的是提供一种检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种检测牛流行热病毒的LAMP引物，由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成，引物的序列如SEQ ID NO：1~4所示。

现有技术中已经存在很多检测其他病原物的LAMP引物，但是，对于牛流行热病毒一直都没有，原因在于，牛流行热病毒（BEFV）和牛赤羽病病毒（AKV）、牛传染性支气管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）很相似，在检测的时候很容易出现交叉反应，所以，要想设计一组专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物非常的困难。本发明充分分析了牛流行热病毒基因序列，筛选出相对保守的基因片段，在保守的基因片段中设计了很多组引物对，最后经过逐一筛选发现，即使是在保守序列中设计的引物也不一定能够专一性的检测牛流行热病毒。最后，经过大量的引物筛选工作，发明人终于找到一组可专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物。

如上所述检测牛流行热病毒的LAMP引物在制备牛流行热病毒检测试剂盒方面的应用。

一种检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒，包含一组LAMP引物，该引物由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成，引物的序列如SEQ ID NO：1~4所示。

优选地，检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒的反应体系如下：

  Bst DNA Polymerase      1.0μL；

  10×Buffer               2.5μL；

  病毒质粒               1.0μL；

  dNTPs Mix（10mM）    3.0μL；

  MgSO₄（100mM）      1.0μL；

  甜菜碱（5M）          5.0μL；

  FIP/BIP                1.6μM；

  F3/B3                  0.2μM；

  DEPC水               定容至 25μL。

优选地，检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒的LAMP反应条件为64℃，反应60min，86℃灭活3min，4℃保存。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明充分分析了牛流行热病毒基因序列，筛选出相对保守的基因片段，在保守的基因片段中设计了很多组引物对，最后经过逐一筛选发现，即使是在保守序列中设计的引物也不一定能够专一性的检测牛流行热病毒。最后，经过大量的引物筛选工作，发明人终于找到一组可专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物。并以该引物建立了检测牛流行热病毒的LAMP方法，该方法灵敏性、特异性和稳定度都很好。

附图说明

图1为温度对LAMP反应的影响；M：DL2000 Marker；1：60℃ ；2：61℃；3：62℃；4：63℃；5：64℃；6：65℃。