[发明专利]多重数字PCR技术在染色体非整倍体筛查中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，具体地涉及利用早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用的多重数字PCR(Multiplex digital PCR，MDPCR)技术对正常妊娠妇女进行无创产前筛查(Non-invasive prenatal screening，NIPS)包括唐氏综合征，爱德华氏综合征，帕陶氏综合征和其他多倍染色体疾病筛查的方法。

背景技术

中国是人口大国，巨大的人口压力会制约社会发展，所以做好优生优育既能提高人口素质，也能制约人口发展，对未来整个民族的生存与发展有重要作用。预防性优生优育主要研究如何降低人群中不利表现型的基因频率，减少以至消除有严重遗传病和先天性遗传病的个体出生，主要包括遗传咨询、产前筛查、宫内治疗等。

据中国出生缺陷干预救助基金会的数据，中国每年新增出生缺陷约90-120万例，约占每年出生人口总数的4-6％。现有8000多万残疾人中，约3000万人是出生缺陷所致。出生缺陷目前已成为儿童致病、致残，甚至死亡的重要原因，其中染色体异常疾病为主要疾病。孕前和孕早期保健以及产前筛查，是避免与降低新生儿缺陷和实行优生优育的最重要关卡。以往，那些具有染色体异常疾病患病高风险的夫妇，对于孕育健康的后代，往往处于无从选择的被动地位。直到1966年，研究发现了孕妇高龄与唐氏综合症的相关性，此后，产前筛查得到迅速发展。产前筛查是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等方面进行检测诊断。从而掌握时机，对可治疗疾病，选择及时进行宫内治疗；对于不可治疗性疾病，如染色体异常疾病等，能够做到知情选择和预防。

染色体异常疾病，是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条染色体上，但多发于如21三体(唐氏综合征)，18三体(爱德华氏综合征)，13三体(帕陶氏综合征)和性染色体异常等，在自发性流产、死胎、早夭中占50％以上，新生儿中发病率约1％，是先天性心脏病、智能发育不全、性发育异常及男女不孕不育等的重要原因。随着染色体分带技术，PCR技术，DNA检测技术等的快速发展，对染色体畸变与疾病关系的认识日益加深，染色体异常疾病检测日趋增多。约15％的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异常所致，即约为5％-8％的胚胎有染色体异常。不过在出生前，90％以上已有自然流产或死产。流产愈早，有染色体异常的频率愈高。染色体异常疾病，迄今尚无有效的治疗方法，只能通过产前筛查/诊断等手段进行一定程度的预防。但目前传统的产前诊断多采用羊膜穿刺等侵入性取样方法，胎儿宫内感染或流产等的风险增加。

上述传统侵入性产前诊断的缺点，导致染色体异常疾病无创产前筛查/诊断方法的出现。目前通用的方法包括以细胞为主体的和脱细胞方法，尤以后者居多。胎儿游离DNA在妊娠母体血液中的存在，和新一代DNA检测技术的不断改进，使得无创产前筛查/诊断更加容易开展。仅需采取孕妇静脉血，利用新一代DNA检测技术对母体外周血浆中的游离DNA片段(包含胎儿游离DNA)进行检测分析从而检测胎儿是否患染色体异常疾病。但妊娠早期，主要来自胎盘细胞的胎儿游离DNA只占母体血液DNA的10-20％。而目前常用的新一代DNA测序技术，检测耗时较长，需用复杂的仪器和生物信息学软件分析大量的DNA序列，1-2周获检测结果，且耗费许多试剂和耗材，价格昂贵。数字PCR(digi tal PCR)是近年来快速发展起来的一种新型定量分析技术，通过将单个样本分成超过数万，甚至数百万、数千万份分布于不同的反应单元，每个单元包含无或一个或多个拷贝的DNA模板，分别对这些DNA模板进行PCR扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行分析。dPCR可不需要对照标准样品和曲线实现绝对定量分析。尤其需要指出的是，将多重PCR技术与dPCR技术有机结合(MDPCR)，便可大幅提高dPCR多重性达20-50以上。

因此本领域迫切需要开发一种早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用的新方法。

发明内容

本发明提供了一种对染色体疾病进行早期筛查的方法。

本发明第一方面，提供了一种体外非诊断性的检测目标染色体非整倍体(Aneuploidy)的方法，包括步骤：

(a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本；

(b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到DNA样本；

(c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中，