[发明专利]利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种莱茵衣藻除细菌与真菌的方法，特别是一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种真核单细胞微藻，具有生长周期短，易于培养，基因组已被注释，相关遗传生化技术与分子生物学技术成熟，具备重金属吸附能力，油脂生产量高等特点，而被作为生命科学研究与应用的模式生物，目前已经开展了纤毛类疾病模型衣藻的研究，以及生物柴油与生物去污的研究。然而在科学研究与应用过程中不可避免的在接种的时候造成衣藻藻种的污染问题，而这些杂菌污染会危及到衣藻藻种的保存，特别是稀有藻种，以及影响研究结果的准确性。

以往的除菌方法包括物理方法与化学方法；

在物理方法中，常用单克隆划线或铺板法与离心沉淀洗脱法。单克隆划线法要求将杂菌污染的衣藻藻种挑取少许进行培养基平板划线，单克隆铺板法要求将杂菌污染的衣藻藻种使用少许液体培养基重悬后再铺平板，培养数日，二者都将使得衣藻细胞与污染杂菌分离，将未污染衣藻单克隆细胞挑出至新的平板，保种。离心沉淀洗脱法要求将杂菌污染的衣藻藻种使用液体培养基重悬后进行低速离心(600g)，使得衣藻细胞体沉淀至底部，去除上清污染液，可多次洗涤沉淀，最后铺板，培养数日，将未污染衣藻单克隆细胞挑出至新的平板，保种。但是上诉常用的物理方法对于污染严重的衣藻藻种的成功率很低，并且离心沉淀洗脱法对于具有高粘附性细菌也是不起作用的。

在化学方法中，Mahan等研究者发现使用20～40ug/mL的多菌灵、甲基托布津、苯菌灵三种苯并咪唑类除真菌剂均可有效去除衣藻的真菌污染(Mahan,2005,BioTechniques)；Kan等研究者进一步研究发现组合使用多菌灵(40ug/mL)、氨苄青霉素(500ug/mL)、头孢噻肟(100ug/mL)可以有效去除混合细菌和真菌的污染(Kan,2009,Journal of Phycology)。然而，现有化学去除杂菌的方法并不是持续有效的，特别是研究环境中持续使用一种混合抗菌剂，会使细菌真菌产生抗性从而引起失效。

莱茵衣藻为Chlamydomonas reinhardtii，在实验室的条件下，易受到操作不当等因素导致细菌与真菌的污染，并且造成衣藻污染的情况复杂多变，污染的细菌真菌的种类不定。

发明内容

本发明的目的是要提供一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法，解决在防治衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染的问题。

本发明的目的是这样实现的：该除菌方法如下：杂菌污染的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行除菌培养5-8天，实现衣藻的除菌；所述的混合抗菌剂包括：10ug/ml抗真菌剂和15ug/ml抗细菌剂；所述的抗真菌剂为嘧菌酯，所述的抗细菌剂为萘啶酮酸。

所述的衣藻即实验藻种为：莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii。

所述TAP固体培养基平板为：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris 2.42g/L，琼脂粉15g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用；所述的TAP盐溶液为：NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L；所述的磷酸盐溶液为：K₂HPO₄288g/L,KH₂PO₄144g/L；Hutner微量元素为：EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃11.4g/L,MnCl₂·4H₂O 5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0。