[发明专利]一种干细胞大规模培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中细胞培养领域，特别是指一种干细胞的大规模培养的方法。

背景技术

干细胞（stem cell）是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞（、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞。

为了充分运用到干细胞的各项潜能，从而，干细胞的培养成为一个关键，传统的干细胞培养有多种方式，虽然在实验室中都能够较好的达到培养的目的，但当转入到工业运行后，则出现了许多弊端，一个非常大的问题即是，传统的培养方法针对干细胞培养时是贴壁生长的特性，从而培养时，比如滚筒培养，干细胞仅能在滚筒的壁上贴附一层，且这一层还不能太厚，从而极大的制约了干细胞往更大规模的培养，也就限制了干细胞的大量产出。因此，为了提高干细胞的大规模培养，需要对培养的方法进行改进。

水凝胶3D细胞培养是在传统2D细胞培养的基础上，以水凝胶(hydrogel)或者固体支架的形式增加一个维度，使细胞像在体内一样生长在三维空间里。3D相对于2D细胞培养的优势非常明显：更接近细胞的体内状态；能够提高细胞因子、抗体及其他生物分子等的产量，细胞在3D环境中比在2D环境中生长更健康；在3D细胞培养系统中，干细胞能够有序分化；实验数据更可靠，如基因表达谱、细胞活动等与体内研究的数据更吻合；能够降低新药研发的成本和周期;可以替代一部分动物实验。而且能够改进细胞培养效率，使干细胞大规模培养成为现实。

为此，市场上已经出现有纳米纤维支架和多孔支架用于干细胞的3D培养， 不过，由于本身纳米纤维支架和多孔支架的材质的原因，一方面成本较高，另一方面，与细胞的相容性等都尚欠缺。

发明内容

本发明提出一种干细胞大规模培养的方法，能够实现干细胞的大规模培养，适于干细胞培养的工业化应用，极具推广价值。

一种干细胞大规模培养的方法，其特征在于：培养过程中采用了PNIPAAm（聚N 异丙基丙烯酰胺）。

进一步，所述PNIPAAm在培养过程中作为干细胞生长的载体基质。

进一步，培养过程中，设置不同的温度梯度，所述PNIPAAm在不同的温度梯度处于不同的相态。

进一步，所述PNIPAAm至少包括固态和液态两种相态。

进一步，所述PNIPAAm在37℃时呈牛奶状凝胶固态，室温25℃时是透明水状溶液液态。

进一步，所述PNIPAAm在固态时作为干细胞生长的支撑基质，液态时用于收集和分离。

所述聚N 异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)为温度敏感型水凝胶，其能够感知外面环境微小变化以及具有良好的生物相容性，当环境温度高于最低临界温度（LCST）时，其体积会突然剧烈收缩，此时其表面是疏水的，细胞可以黏附生长，当细胞长到一定密度后，降低温度到LCST下，使水凝胶表面亲水，这样细胞就会脱离水凝胶，而不用传统的酶消化，很好的保持了细胞表面的结构与功能，避免了酶消化细胞的操作繁琐，大大减少了工作量。

聚N 异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的大分子链上同时具有亲水性的酰氨基和疏水性的异丙基，水溶液具有最低临界温度(LCST) 32℃，能够在37℃交联成水凝胶，在常温下则为线型的水溶液。利用PNIPAAm在LCST附近发生可逆相转变的特性，可以将PNIPAAm设计成分子开关，结合干细胞培养，用聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）的温度敏感性，使细胞在临界温度之上时贴附在材料表面生长，温度在临界温度以下时细胞脱附，改变了传统的酶解脱附细胞的方法。且细胞在水凝胶三维空间里，细胞生长状态良好且状态培养效率升高。

进一步，培养过程包括以下步骤：

1、干细胞专用培养液培养干细胞。

称取一定量的聚N-异丙基丙烯酰胺粉末于15ml离心管中，加入适量的干细胞专用培养液将它溶解。

2、胰蛋白酶消化：小心吸去旧培养液，用PBS清洗2-3遍，加入适量胰蛋白酶液，37℃消化2-3分钟，显微镜下观察细胞，细胞胞质回缩，不再连接成片，表明细胞消化适度，加入等量的培养液（含10%胎牛血清）终止消化。用枪将已经消化好的细胞吹打成悬液，加入15ml离心管中，离心，弃去上清，加入培养液将细胞吹打均匀，计数。