[发明专利]一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积(confinement area)的方法。

背景技术

细胞质膜的多种重要功能都与膜的流动性密切相关。作为细胞质膜的重要组成部分，膜蛋白可以发生侧向扩散及胞吞循环，通过这些运动在信号传递及物质运输中起着非常关键的作用。因此，检测膜蛋白的分布及扩散运动已成为研究生物膜的一个重要内容。然而，这种在纳米级别的膜结构上微秒尺度的快速运动，用常规的显微镜成像是无法观察到的。

通过荧光标记，运用高分辨率的单分子成像技术可以实现在纳米级别上对膜蛋白分子的动态进行活体成像，结合单颗粒追踪技术(single particle tracking,SPT)，可以得到膜蛋白分子的个体特异性质，经过统计也可以得到群体的平均值，从而揭示接近生理活性状态下的膜蛋白运动特征。然而，具体如何实现这一目的，在现有技术中尚未有明确报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法。其中，所述侧向受限面积是蛋白质在细胞膜上扩散时所被限制的区域范围的面积。所述侧向受限面积具体是指，蛋白质在细胞膜上的扩散由于细胞骨架作用、膜筏微区作用、分子间相互作用等原因而被限制在一定区域范围内，这个区域的面积被称为侧向受限面积。

本发明所提供的检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，具体可包括以下步骤：

(1)将待测细胞膜蛋白的编码基因与荧光标记蛋白的编码基因进行融合，得到融合基因，将所述融合基因导入受体植物，获得转基因植物；所述转基因植物表达所述融合基因编码的融合蛋白，从而在所述转基因植物中实现对所述待测细胞膜蛋白的单色荧光标记；

(2)使用可变角全内反射荧光显微镜(variable angle-total internal reflection fluorescence microscope,VA-TIRFM)对所述转基因植物的活体材料进行观察，获得时间序列图像；

所述时间序列图像为检测被所述荧光标记蛋白进行了单色荧光标记的所述待测细胞膜蛋白时，在可变角全内反射荧光显微镜下连续拍摄的图像(如连续拍摄50-200帧)；

(3)利用单颗粒追踪技术(SPT)对所述时间序列图像中的荧光点进行识别和追踪，得到荧光点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移(mean square displacement，MSD)；

(4)利用Origin软件(如Origin8.6软件)将步骤(3)所得的荧光点随时间的平均平方位移进行拟合，拟合的方程为如下式I：

y＝A₁-A₂e^-kx式I

拟合时，以所述平均平方位移作为y值，以所述时间为x值，通过拟合得到常数A₁的值；

将A₁的值代入如下式II，计算获得L²的值：

L²＝3A₁式II

式II中，L²为荧光点在细胞膜上的运动范围(μm²)，即为所述待测细胞膜蛋白的侧向受限面积。

在所述方法的步骤(1)中，所述待测细胞膜蛋白最好为来自于所述受体植物的蛋白，当然也可以为其他来源的植物蛋白。所述待测细胞膜蛋白为在所述受体植物的表皮细胞中表达的细胞膜蛋白。所述表皮细胞具体可为来自于所述受体植物的根、胚轴或叶片等部位的表皮细胞，这是为了以便于可变角全内反射显微镜的检测。

在本发明中，所述荧光标记蛋白具体为绿色荧光蛋白GFP。所述待测细胞膜蛋白具体为拟南芥向光素phot1。所述植物具体为拟南芥。

进一步，在本发明的一个实施例中，所述转基因植物具体为在phot1-5突变体背景下转入融合基因phot1-GFP的拟南芥，该拟南芥来自文献“Sakamoto and Briggs.Cellular and subcellular localization of phototropin 1.Plant Cell,2002,14:1723-1735”中。

在本发明中，步骤(2)中，使用所述可变角全内反射荧光显微镜对所述转基因植物的活体材料进行观察的过程中，采用的激发波长为473nm或488nm，曝光时间为100ms或200ms，EMCCD增益值为345，连续拍摄图像50-200帧(如200帧)。