[发明专利]一种葛花降糖活性的定量检测方法

权利要求书

1.一种葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）葛花供试药物的制备：

将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量8~12倍的双蒸水浸泡25~35分钟，超声提取15~25分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光4℃保存；

2）检测用溶液的配制：

（1）制备PBS磷酸缓冲液：

将2.0-2.5g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.2-3.6g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30-31ml、KH₂PO₄母液29-31ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉9-11mg溶于28-32ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入55-65mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

（3）制备PNPG溶液：

将85-95mg PNPG溶于28-32ml双蒸水中，得PNPG溶液；

（4）制备Na₂CO₃溶液：

将10-11g无水Na₂CO₃溶于90-110ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

取对照品40~60mg，溶于0.5~1.5ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

在样品管中加入葛花供试药物0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.3~0.4ml、对照品溶液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温8~12min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.2~0.3ml，35~40℃保温 18~22min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.4~0.6ml，静置4~6min，从上述管中分别取180~220μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

根据预实验与待测样品葛花的效价估计，对待测样品与对照品阿卡波糖的加样量进行调整，调整葛花在0.17mg•mL^-1～0.68mg•mL^-1剂量范围内，阿卡波糖在0.0025mg•mL^-1～0.0100mg•mL^-1剂量范围内，当待测样品与工作对照品在线性范围内反应曲线呈良好的平行关系，通过可靠性检验，即直线回归P < 0.01, 偏离平行、二次曲线和反向二次曲线P>0.05，平均可信限率 FL%在15%以内，将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现对葛花质量的评价。