[发明专利]蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株及其培养方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种蒺藜内生菌中具有普鲁兰酶活性的菌株及其培养方法。

背景技术

蒺藜Tribulus terrestris L.为一年生草本植物，全国各地均有分布，其鲜嫩营养器官可做牲畜饲料，果实则可入药，具有治疗头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障、风疹瘙痒之功效。植物内生菌是重要的微生物遗传资源组成部分，因特殊的寄生或腐生环境，往往具有与土壤微生物不同的生理特性。关于传统药用植物蒺藜的内生菌研究尚未见报道。

普鲁兰酶产生菌一直是微生物功能酶中的研究热点之一。普鲁兰酶是一种能够专性水解α-1，6糖苷键的脱支酶，既是支链淀粉降解不可或缺的关键酶，也是洗涤工业的一种常见添加剂。截至目前，世界范围内普鲁兰酶商品的绝大部分市场份额仍然是由丹麦NOVO公司所占有。国内外也有不少关于普鲁兰酶产生菌的报道，但绝大多数野生菌株活性较低，即使是通过基因工程技术构建的工程菌株，也往往难以达到理想的发酵效果，酶活性稳定性较差。自然界的微生物资源极其丰富，被人们培养、鉴定和开发利用的仅占极少部分，所以，通过试验材料、试验方法、培养基创新等研究手段的改进，不断的筛选和积累产功能酶菌株仍然是一项长期而艰巨的研究工作。

目前，各类文献报道的普鲁兰酶产生菌的筛选及鉴定方法大同小异，主要技术环节如下：

筛选普鲁兰酶产生菌常用的样品类型主要有：常规大田土壤、河水、海水、河底和海底淤泥、淀粉厂区土壤等。

筛选普鲁兰酶产生菌最常见的分离培养基配方是：糯米淀粉25g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，琼脂粉20g，加水溶解后定容至1000mL，pH值为6.0。

普鲁兰酶产生菌鉴别培养基配方是：蛋白胨10g，酵母膏2g，红色普鲁兰糖3g，NaCl 2g，琼脂20g，加水溶解后定容至1000mL，pH值为7.0。

普鲁兰酶活性的测定最常用的方法是3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。

普鲁兰酶产生菌系统菌鉴定的方法主要包括菌体(菌落)形态、生理生化指标的测定和16S rDNA序列分析。

试验操作的一般技术流程是：采集试验样品——富集培养——初筛分离培养——鉴别分离培养(复筛)——普鲁兰酶活性测定——菌株鉴定——下游研究。

虽然目前有一些产普鲁兰酶野生菌株的文献报道，但真正能够用于工业化生产是菌很少，迄今为止，应用最为成功和广泛的仍然仅有Bacillus acidopullulliticus。所以，普鲁兰酶活性较高野生菌株的匮乏仍然是限制普鲁兰酶广泛开发应用的瓶颈问题之一，直接或间接的影响了普鲁兰酶产生菌的菌诱变育种和工程菌株的构建。就我国关于普鲁兰酶研究情况来说，突破性的研究成果很少，普鲁兰酶专利菌株较少，仍未形成有竞争力的核心菌种资源后备库， 没有改变国外在普鲁兰酶生产领域处于垄断地位的现状。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一是为提供一种蒺藜内生菌中具有普鲁兰酶活性的菌株及其人工培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株，其菌株属肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学，保藏号为CCTCC M 2015071，该菌株具有普鲁兰酶活性。

本发明提供的一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株的培养方法，包含以下培养步骤：

富集培养：取蒺藜的健康茎冲洗后剪成小段，两端用融化的石蜡封口，再用无菌水冲洗，放入体积百分比为70％乙醇溶液表面消毒，再用0.1mol/L升汞消毒，无菌操作条件下剪去两端的封口石蜡，将剩余的茎放入研钵充分研磨，收集于装有富集培养基的试管中摇床培养。

分离培养：无菌操作条件下取适量富集培养液涂布于固体分离培养基中培养。用接种环选取单菌落，在固体分离培养基平板上划线纯化。然后通过滴加卢氏碘液的方法初筛产普鲁兰酶菌株，选菌落小而水解圈较大者作为目标菌株。

复筛：将所述目标菌株接种于鉴别培养基中培养，然后滴加卢氏碘液，将具有水解圈者确定为具有普鲁兰酶活性的菌株，同时转接于LB培养基4℃斜面保藏。