[发明专利]一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌及构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种产L‑肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建方法和用途。所述基因工程菌是通过将编码巴豆甜菜碱转化为L‑肉碱的三个关键基因caiB、caiC和caiD连同转运子编码基因caiT和正调控子caiF一起转入大肠杆菌中过表达，通过厌氧启动子控制或IPTG诱导L‑肉碱合成相关基因的表达，同时删除大肠杆菌自身的编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶/激酶的aceK基因。基因工程菌经产酶培养后，收集菌体作为全细胞酶源，直接转化巴豆甜菜碱生成L‑肉碱，经转化后，L‑肉碱产量最高可达30g/L以上，摩尔转化率最高为42％，产量和转化率比野生株提高了60倍以上，达到国内报道的生物法制备的领先水平。本发明的基因工程菌对底物的转化效率高，酶反应工艺简单，生产原料成本低廉，节约资源，无污染。

技术领域

本发明涉及一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌及构建方法和用途，属生物工程技术领域。

背景技术

L-肉碱(左旋肉碱，L-Carnitine)又称维生素B_T，是一种维生素制品，与动物体内脂肪酸代谢有关。当动物因先天性或代谢性疾病引起体内肉碱缺乏时，会使机体乏力和产生许多心血管疾病。目前L-肉碱除了以强化营养方式用于婴儿和体弱多病者外，还作为药物用于降低血脂、减肥和医治心血管疾病，由于其疗效显著正引起人们的极大兴趣与关注。近年来，L-肉碱被广泛应用于医药、保健和食品等领域，被瑞士、法国、美国和世界卫生组织规定为法定的多用途应用剂，具有很大的应用市场。

L-肉碱的生产方法主要有化学合成法、直接提取法、微生物发酵法和酶转化法等。目前，国内主要采用化学合成法生产，首先合成DL-混旋肉碱，然后进行拆分得到L-肉碱，该方法环境污染较大，并且D-肉碱副产物废弃造成资源浪费。而直接从牛肉等提取法，成本太高产量太低，几乎没有应用价值。微生物发酵法和酶转化法是最有应用价值的方法，目前商业化使用的底物主要有γ-丁基甜菜碱和巴豆甜菜碱。CN101014709A使用粗糙脉孢菌来源的γ-丁基甜菜碱羟化酶，利用γ-丁基甜菜碱为底物进行酶转化生产L-肉碱，该方法涉及的酶纯化步骤繁多，酶转化反应辅助因子众多，生产成本太高。CN101068925将来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶、6-N-三甲基赖氨酸羟化酶、3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶、γ-三甲基氨基醛脱氢酶与γ-丁基甜菜碱羟化酶等五个编码基因构建到大肠杆菌的T7过表达质粒中，转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)体内，在含有赖氨酸的培养基中生产L-肉碱的产量为19.8mg/L。巴豆甜菜碱为底物的转化方法有其独特优点，底物便宜，且可利用拆分废物D-肉碱进行脱水制备，但一般菌株均不耐巴豆甜菜碱，需经过大量的筛选工作获得高耐受性的菌株。EP0457735A1使用筛选的奇异变形杆菌能转化底物浓度为12％的巴豆甜菜碱生成L-肉碱，摩尔转化率为40～43％，转化率有待提高。而采用全细胞酶转化巴豆甜菜碱可以克服菌株对底物的高浓度不耐性，如CN96117166.9使用大肠杆菌的紫外诱变株对巴豆甜菜碱进行转化，L-肉碱产量最高达15～20g/L，转化率为40～50％，此值还达不到工业化生产水平，产量和转化率都有待提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌及构建方法和用途。通过基因重组技术获得具有高转化活性的大肠杆菌基因工程菌，并结合全细胞酶转化工艺优化，大大提高L-肉碱产量，达到生物法制备L-肉碱的产量和转化率的领先水平。

本发明通过以下方案来实现：