[发明专利]一种制备成熟红细胞的方法

权利要求书

1.一种制备成熟红细胞的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）提取并纯化来自胎盘源血的单个核细胞，或提取纯化来自于胎盘源血的造血干细胞CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-、造血前体干细胞CD133⁺CD34⁺、早期造血前体干细胞CD133⁺CD34^-或红系干／祖细胞CD34^＋CD72^＋中的一种或多种；

所述的胎盘源血通过以下方法获得：在无菌的环境中打开胎盘，采用无菌生理盐水、磷酸缓冲液、DMEM或1640培养液冲洗胎盘，一直到胎盘外的剩余血都冲洗完毕，在脐静脉靠近胎盘组织内，温度20-40℃，将导管插入到胎盘源血管内，然后用无菌胶布在脐静脉和导管处固定，采用同样的方法，用两根导管分别插入脐动脉内，并固定，然后这些导管外接一个输液袋，来清洗胎盘24-36个小时，在此过程中，不断挤压胎盘，使胎盘内的液体不断流到收集瓶中，收集瓶中的液体体积在300-2000毫升之间，清洗液为生理盐水，磷酸盐缓冲液或DMEM-1640培养液，含有50-100单位/mL的青霉素或50-100微克/ml的链霉素，以及1-10单位/ml的肝素，导出流速为每分钟10-50毫升，挤压胎盘速度在开始较慢而后加快，当流出液不再发红，或细胞数低于100/毫升时，此时收集的液体为胎盘源血，里面的细胞为胎盘源血细胞；

（2）从纯化的单个核细胞或纯化的CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-、CD133⁺细胞、红系干／祖细胞CD34^＋CD72^＋中的一种或多种中扩增干细胞：取 1x10⁶/ml的单个核细胞置入培养瓶，所用的培养液为无血清培养液SFEM并和以下细胞因子共同培养细胞:1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，50-200ng/ml Flt3-L，10-100ng/ml BMP4，10-100ng/ml IL-3，10-100ng/ml IL-11和1-10单位/ml EPO，每3-5天取细胞离心，更换新培养液，在换2-5次培养液后收集细胞用于下一步培养；

（3）细胞定向培养：取收集的上一步培养的细胞，离心1000rpm，去上清液，换用新的无血清SFEM培养液，并和以下细胞因子共同培养细胞：1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，10-100ng/ml BMP4 ，10-100ng/ml IL-3，10-100ng IL-11，50-200ng/ml IGF-1和2-100单位/ml的EPO,每2-5天换新培养液，在换2-5次培养液后，获得有核红细胞，收集细胞用于下一步培养；

（4）取收集的上一步获得的有核细胞，将其转移到间充质干细胞铺底的培养瓶内培养3~7天，其中所用的培养液为含2-10单位/mL EPO的无血清培养液SFEM，或者含2-10单位/mL EPO的加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM；

（5）取上一步培养的细胞在换液时使用不加任何细胞因子的培养液，还在间充质干细胞的环境下培养，此时扩增生成的红细胞，即为无核成熟的红细胞；其中所使用的培养液选自无血清培养液SFEM，或者加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM。

2.根据权利要求1所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于步骤（1）所述的单个核细胞为单独提取自胎盘源血的单个核细胞。