[发明专利]一种连续化生产c-di-AMP的方法

说明书

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种采用固定化DisA蛋白连续生产c‑di‑AMP的方法。该方法步骤：1、DisA基因改造，通过基因工程手段，将DisA基因与cbm基因融合构建重组质粒载体；2、重组质粒转化，CBM‑DAC融合蛋白的表达；3、一步纯化和固定化DAC酶；4、连续化生产c‑di‑AMP；5、反应产物分离浓缩与纯化。本发明特异性的利用了CBM结构域与纤维素结合但无水解功能的特点，工艺较为成熟，生产成本低廉，环境友好，所制备的DAC酶类型多样，来源广泛，而且浓度、纯度较高，酶促反应效率较高，因而具有较好的开发应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种采用固定化DisA蛋白连续生产c-di-AMP的方法。

背景技术

环腺苷二磷酸（Cyclic 3’，5’-diadenosine monophosphate，c-di-AMP）是近几年在细菌和古菌中发现的一种新型的第二信使。作为一个在原核微生物中广泛存在的信号分子，它是细胞生长的必需因子，不仅参与细胞壁合成、细胞形态的控制、细菌DNA的损伤性修复，而且与细菌对抗生素的抗性、病原细菌的致病性相关； c-di-AMP还能刺激真核宿主细胞产生免疫应答，介导宿主产生干扰素，增强机体非特异性免疫的防御能力。然而，目前对于c-di-AMP的作用机制研究还处于起步阶段，是近几年研究的热点，导致科研市场对纯品的c-di-AMP有较大的需求。另一方面，最新研究表明，c-di-AMP可以作为一种小分子免疫佐剂，能够强烈和长期持续刺激机体产生免疫应答，因此，它在疫苗佐剂的市场也存在巨大的潜力。有文献报道可以通过化学法在使用对甲氧基保护的亚磷酰胺固相支持物表面合成c-di-AMP，但因工艺复杂、回收率低、环境不友好和成本过高等问题，难以规模化工业生产。

c-di-AMP合成酶（dia-denylate cyclase，DAC）在三域生命系统中几乎都存在，可以在体外将两分子的ATP合成一分子c-di-AMP，同时生成一分子焦磷酸（图1）。最近一篇文献中Cao Zheng等(Enzyme and Microbial Technology（52）2013，319-324)证实：在大肠杆菌中表达带有组氨酸标签的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的DisA 蛋白，具有DAC功能，从50mL反应体系中检测到100mg的c-di-AMP产物。然而，该研究对产物的分离提纯工艺并未进一步研究，限制了其在规模化生产中的应用。另外一项国际专利：WO2013/066264 A1（Enzymatic synthesis of cyclic and linear diadenosine monophosphate）提出使用来源于Methanocaldococcus jannaschii 和Geobacillus thermodenitrificans 的两个具有DAC功能的耐热蛋白生物催化合成c-di-AMP，同时生产焦磷酸。