[发明专利]一种以L-苯丙氨酸为氨基供体的L-苯甘氨酸转氨酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种通过基因工程技术和发酵的手段过量表达的L-苯甘氨酸转氨酶及其应用。

背景技术

L-苯甘氨酸是一种不参与蛋白质合成的非蛋白氨基酸，它是普那霉素和维吉尼亚霉素等抗生素的合成前体，也是合成艾滋病病毒蛋白酶抑制剂和抗癌药物紫杉醇的前体，同时还是合成多肽激素以及多种农药的重要中间体，被广泛应用于药物学领域。合成后的医药产品既可注射又可口服，所以在医药市场前景广阔。

磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5’-phosphate，PLP)是维生素B6的活性形式，PLP依赖的酶分子广泛存在于生物界中，原核生物中1.5％的基因产物需要PLP作为辅酶或辅基，其中多数为氨基酸转氨酶(EC 2.6.1)(Percudani R,Peracchi A.A genomic overview of pyridoxal‐phosphate‐dependent enzymes[J].EMBO Rep,2003,4(9):850-854)，天冬氨酸转氨酶家族即为其中的典型代表。磷酸吡哆醛依赖的氨基酸转氨酶参与到氨基酸的合成、降解和转换过程中，是连接碳代谢和氮代谢的桥梁，可以调节细胞中一碳单位和生物胺的浓度。PLP酶(即依赖于PLP的酶)与氨基酸底物结合的转氨过程具有共同特征：PLP通过亚胺键与赖氨酸残基的ε-氨基共价结合，形成所谓的“内”醛亚胺，在第一个阶段的反应中，底物氨基酸的氨基取代赖氨酸的ε-氨基，形成“辅酶-底物”结合的亚胺键，这种“外”醛亚胺中间体广泛存在于PLP参与催化的反应当中(Mehta P K,Christen P,Purich D.The molecular evolution of pyridoxal-5′-phosphate-dependent enzymes[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol.2000；74:129-184)；在第二个阶段的反应中醛亚胺在不同位置上接受或失去一个质子变构为酮亚胺，之后酮亚胺水解，变为磷酸吡多胺和对应的酮酸(Toney M D.Reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes[J].Arch Biochem Biophys,2005,433(1):279-287)，再进行一次相反方向的反应，便完成一次转氨过程。发明人首次报道了一种具有L-苯甘氨酸转氨酶活力的L-苯甘氨酸转氨酶及其重组表达和应用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种以L-苯丙氨酸为氨基供体的L-苯甘氨酸转氨酶及其应用。本发明得到的L-苯甘氨酸转氨酶HpgT具有L-苯甘氨酸转氨酶活力，能够以L-苯丙氨酸为最适的氨基供体，能够高效催化苯乙酮酸生成L-苯甘氨酸。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种重组L-苯甘氨酸转氨酶蛋白在催化苯乙酮酸到L-苯甘氨酸的反应中的应用，所述重组L-苯甘氨酸转氨酶蛋白来自于东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis CGMCC 4.1286)，以L-苯丙氨酸为最适氨基供体。

进一步地，所述重组L-苯甘氨酸转氨酶蛋白由428个氨基酸组成，隶属于天冬氨酸转氨酶家族成员。

重组L-苯甘氨酸转氨酶蛋白在催化苯乙酮酸到L-苯甘氨酸的反应中，催化反应采用L-苯丙氨酸为最适氨基供体。

本发明提供了一种重组L-苯甘氨酸转氨酶蛋白的基因序列的表达系统，将L-苯甘氨酸转氨酶基因编码序列插入表达系统中的表达载体进行表达。

进一步地，所述表达载体为原核表达载体。

进一步地，所述表达载体为pEThpgT_AO。

本发明提供了重组L-苯甘氨酸转氨酶的制备方法，具体步骤为：

(1)获取L-苯甘氨酸转氨酶hpgT_AO基因编码序列；

(2)构建L-苯甘氨酸转氨酶hpgT_AO的pET-28a(+)，以获取所需L-苯甘氨酸转氨酶hpgT_AO基因编码序列；

(3)将L-苯甘氨酸转氨酶hpgT_AO基因编码序列插入表达载体；

(4)将表达载体导入感受态细胞，并使之表达，获得L-苯甘氨酸转氨酶HpgT_AO；

(5)将L-苯甘氨酸转氨酶进行检测，检测合格后进行酶活力测定。