[发明专利]反映空气中可吸入颗粒物累积影响的唾液DNA甲基化标志物与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于遗传学、分子生物学、基因组学和生物健康监测以及疾病预防技术领域，涉及一种适合于家庭等场合应用的健康监测与环境风险评估技术，特别地，涉及可用于检测空气污染(如PM2.5)对人体影响的基因甲基化位点。

背景技术

据报道空气中颗粒物质(PM)的暴露与肺癌风险的增加密切相关，实验和流行病学研究表明，PM的质量可能诱导癌变相关的生物学变化。空气污染如PM是肺癌和心血管疾病的重要诱因，对于个体在日常生活中受空气污染影响的情况进行监测与评价，对于提高生活质量、预防疾病具有重要的意义。许多基因被认为与肺癌有关，但还不是很清楚的是：空气污染如PM会影响到哪些基因，对受影响的基因有何作用。因此，有必要深入研究空气污染如PM影响的基因以及其在基因水平的作用机制。

基因可通过在胞嘧啶上甲基化来调控基因表达，尤其是启动子区5’CpG岛的甲基化在人类癌症的发展中已成为最重要的表观遗传机制之一。本领域中有多种方法检测DNA的甲基化。甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern(MSRE-PCR/Southern)方法是利用甲基化敏感性限制性内切酶将DNA切割为大小不同的片段，并进行PCR/Southern分析的方法。该方法是基于限制性内切酶的甲基化分析方法。另还有基于经重亚硫酸盐处理的，以及在此基础上衍生出的一些甲基化分析方法，例如重亚硫酸盐测序法(Bisulphite Sequencing)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfiterestriction ana lysis,COBRA)等等。近年来涌现出不少基于全基因组的甲基化分析方法，也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)，该方法检测样本量大，可检测多个位点。例如，基于MassARRAY技术的飞行质谱分析方法可实现多重CpG的检测；基于高通量测序的分析方法；以及基于芯片的甲基化图谱分析：安捷伦的Human CpG Island Microarray Kit、Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片和Infinium Human Methylation450 BeadChip芯片等等多种甲基化分析方法。

发明内容

目前，绝大部分对基因甲基化分析的研究都是以血液样品作为对象。由于需要对个体进行多次采样，为提高受试者的依从性，本发明没有采用文献中普遍使用的血细胞DNA甲基化检测，而是采用了取样更为方便的唾液DNA甲基化检测。唾液中含有钠、钾、钙、镁等多种电解质，糖蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶、唾液淀粉酶等各种蛋白质，还有可从中获得遗传信息的脱落口腔上皮细胞。唾液含有丰富的人体健康信息且易于获取，因此相对传统的血液样品，唾液是一个更为理想的便捷的样品对象。DNA的甲基化并不是一成不变的，会在环境因素、生活习惯，心理状态等各种因素的影响下发生变化，且近期的研究表明，唾液、血液、精液等体液中的DNA甲基化差异非常大。因此，唾液的DNA甲基化变化可反映外界各种因素对人体的影响。针对唾液进行相关甲基化研究，获取唾液中DNA甲基化标志物是非常重要的。

本发明对空气中可吸入颗粒物与唾液中F2RL3基因甲基化之间的相关性进行评估，同时找到一种分析唾液中DNA甲基化变化的新的检测方法。而且，发明了一种评估空气污染如空气中可吸入颗粒物对身体造成影响的评价方法。

本发明的目的在于提供一种检测空气中可吸入颗粒物对人体影响的试剂盒，其利用唾液作为检测对象，能够检测唾液DNA中F2RL3基因的核苷酸区段的甲基化，所述F2RL3基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一目的在于提供所述核苷酸区段在F2RL3基因SEQ ID NO： 1中的位置为1627～1832，具体序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的另一目的在于提供的试剂盒用于检测所述核苷酸区段在SEQ ID NO：1的第1671、1682、1723、1758、1773、1791和1802位的七个CpG位点中任一位点的甲基化。

本发明的另一目的在于提供的试剂盒，采用sequenom公司的飞行质谱方法检测所述核苷酸区段的甲基化情况，并提供检测所用的引物对。

本发明的另一目的在于提供的引物对可以在严格条件下与SEQ ID NO：2的基因序列杂交。